干细胞与肝治疗

干细胞与肝治疗摘要：目前原位肝移植是治疗暴发性肝功能衰竭公认有效的方法，但严重供体短缺及费用昂贵等问题限制了其广泛应用，有些患者甚至在等待供体过程中死亡，因此迫切需要一种方法能够暂时替代补充衰竭肝脏的功能，使病人能“桥接”肝移植或自行再生恢复，肝细胞移植作为治疗暴发性肝功能衰竭的一种选择在各种动物模型及临床应用中得到广泛证实，与原位肝移植比较具有创伤小、安全简单、一肝多用、抗原性低等优点，但移植的肝细胞增殖困难及供体缺乏等问题严重困扰着肝细胞移植的发展；肝干细胞即目前所谓的肝卵圆细胞，因其强大的增殖能力及向肝细胞和胆管上皮细胞等多种组织分化潜能，作为肝细胞移植理想的细胞来源已成为研究热点，但利用肝脏来源的肝干细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭目前尚未见报道。

中医中药在肝病治疗过程中积累了丰富的经验，近年来许多学者从天然中药中发现多种方剂和中药科属对肝损伤有很好的保护作用，茵陈汤具有利胆、保肝褪黄、抗炎抗菌等作用，已广泛应用于临床治疗各种肝炎。

本课题分为三部分：第一部分在建立大鼠肝干细胞增殖模型的基础上分离、纯化大鼠肝干细胞，并移植治疗暴发性肝功能衰竭大鼠模型；第二部分将分离、纯化的人胎儿肝干细胞异种移植治疗SCID小鼠暴发性肝功能衰竭模型；目的是探索肝细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭的可行性、有效性及可能的作用机理，为肝干细胞移植应用于临床治疗各种终末期肝病打下坚实基础。

第三部分利用加味茵陈汤治疗暴发性肝功能衰竭大鼠模型，并以含中药血清作用于肝细胞体外损伤模型，从不同水平探索本组方的保肝、降酶及促进肝细胞再生作用，以更好的应用于临床，而且为进一步研究中药对肝干细胞的影响奠定基础关键字：肝干细胞;卵圆细胞;细胞分离;细胞移植;暴发性肝功能衰竭；肝硬化一、肝干细胞的最新发展：干细胞移植术是近年发展起来的新技术。

其方法是先从肝硬化患者身上抽取少量骨髓，再用高科技手段分离，提取骨髓干细胞，经培养当干细胞数量达到一定量后，在介入条件下将分离出来的干细胞经肝动脉注入肝脏，手术即完成了。

其基础原理是基于干细胞有着很强的“因地分化”特性，就是在什么样的环境条件引导下分化为什么样的细胞。

所以当“种肝术”到患者的肝脏组织后，就像种入肝脏的种子，在一定微环境调控下“入乡随俗”地成长发育为干细胞，然后增殖长出新的肝细胞，承担起病肝不能胜任的工作，促使病肝重获生机。

该技术实施过程机理肯定，加上干细胞采自于患者自身，不用担心发生排异反应，具有成功率高而风险非常小的优点。

目前世界范围内已有数千例终末期肝病患者接受了自体干细胞移植术治疗，效果非常惊人。

已被公认为是除肝移植之外能够从根本上解决重症肝炎、肝硬化疾病的“第二条终极途径”。

资料显示：患者大多可在2—4周内腹水等症状消失或减轻，随着新生干细胞的增多或肝组织的修复，约三个月左右患者肝功能、凝血机制出现明显改善，谷丙转氨酶降低，总胆红素下降，白蛋白大幅升高，大部分化验指标可恢复正常，术后患者康复情况良好。

治疗肝硬化的理想策略应包括纤维化的预防，刺激肝细胞增生和重建肝组织结构。

近年来，随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展，以及对干细胞研究认识的深入，通过干细胞移植治疗肝硬化逐渐成为研究的热点。

从目前各国的研究和应用情况来看，“干细胞移植”是最期待的新技术之一，尤其近两年国内外关于自体骨髓干细胞移植治疗终末期肝病的报道和临床报告较多，都传递出了积极的信号。

大多数的临床应用效果评定，一般是按照移植1、2、4、8、12周后，几项重要生化检查指标的改善情况。

平均来说，有80%—90%的患者，丙氨酸转氨酶、总胆红素出现大幅度降低，白蛋白、凝血酶原治动度、胆碱脂酶活力、胆固醇显著升高，临床症状有明显改善，如腹水减轻、食欲改善、乏力好转等，并且腹胀减轻。

在岐黄医院在技术上进一步升级，进行的的干细胞移植术案例成功率100%，专家认为，肝脏疾病在接受自体骨髓干细胞移植后，病肝细胞数量可以得到恢复，病肝组织结构可以得到修复，肝组织的功能得以延续，从而可明显提高患者生存状态，并大大延长寿命。

由于移植供体可以自体采集，避免其他方式移植可能出现的排斥反应；移植过程简便易行、治疗费用低廉;而且不涉及伦理道德等问题为肝硬化等晚期肝病患者提供了新的希望，为肝硬化治疗开辟了新的途径。

二、肝硬化与肝干细胞：肝硬化是临床常见病、多发病，该病进入失代偿期后逐渐发展,最终可能导致肝功能衰竭。

在治疗上一直以来并没有令人满意的进展，临床上主要仍以保肝对症及预防并发症为主，尤其是终末期肝病的治疗总体效果不甚理想。

近年来原位肝移植已成为终末期肝病最理想的治疗选择，但供体的紧缺、移植后的免疫排斥反应以及高额的治疗费用限制了其临床应用。

干细胞移植治疗已在医学领域取得了令人瞩目的成就,也为终末期肝病的治疗提供了新方法。

大量文献报告,在肝损伤及肝细胞再生的过程中，干细胞起着重要作用，干细胞在特定环境下可分化成肝细胞，从而参与肝功能的修复和重构。

干细胞治疗肝硬化是目前世界上最前沿的医疗技术。

武汉中山医院干细胞治疗中心是采用新生儿的脐带，然后通过介入方法把提取的干细胞注入病肝，这些干细胞便在肝内“落户”，并“入乡随俗”地分化为肝细胞。

新生的肝细胞便承担起病肝不能胜任的“工作”，从而明显改善了病人的肝功能。

就好象轻松地给病人移植了肝脏。

干细胞移植不存在免疫排斥及伦理问题，是一种具有广阔应用前景的有效治疗手段。

我国是肝病大国，仅乙肝患者就有上千万之多，而其中每年需要肝脏移植手术的患者也有数十万。

可是可供移植的肝脏来源少得可怜，况且器官移植的费用之高也令患者望而却步。

干细胞治疗肝硬化，对于严重肝炎、肝硬化患者的肝功能异常甚至衰竭的改善非常有效，而且所需费用较肝脏移植低几十倍，治疗过程中患者几乎没有痛苦。

根据专家们的研究发现，原发性胆汁性肝硬化是各种肝损伤共同的终末阶段，其特点是肝细胞变性和坏死。

由于肝硬化早期经过积极防治后可以逆转或不再进展，而晚期将严重影响患者的生活质量，可能出现上消化道出血，肝肾综合征，肝性脑病等严重并发症。

甚至发展为肝癌危及生命，因此，积极对肝硬化的防治非常重要。

目前晚肝硬化尚缺乏特效的治疗手段，最好的选择是原位肝移植，但是肝脏移植存在供肝奇缺、费用昂贵及术后免疫移植排斥反应等诸多难题，这大大限制了肝移植的临床应用。

而北京市解放军261医院干细胞治疗中心的“干细胞治疗技术”治疗肝硬化，效果显著，痛苦小，副作用小，操作过程相对简单、术后不存在肝移植免疫排斥和伦理问题，且费用相对低廉，为肝硬化患者的治愈带来了新的希望。

三、肝细胞治疗肝病的机制：肝部分切除后肝叶增大直至恢复原肝的质量、慢性乙型病毒性肝炎后期的结节性肝硬化和肝癌切除术后癌的复发(可能是转移灶)等现象均表明肝脏具有很强的再生能力,生长因子和细胞因子启动和调控肝脏再生。

参与肝再生的成体肝干细胞(adulthepatic stemcells,DHSC)是肝细胞发育、增殖、分化和癌变等生理、病理过程中的关键角色。

最近的研究发现wnt信号途径关键蛋白β-catenin直接参与靶基因的转录和细胞间的粘附,不仅是细胞增殖和分化的强力调节因子,而且促进干细胞(stem cell)的维持和自我更新、干细胞特化和影响细胞系命运决定。

wnt信号途径在干细胞发育,包括增殖、分化、调节等过程,和在肝及结肠癌发生、发展和转移过程中也发挥非常重要的作用。

肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)具有分化成肝细胞和胆管上皮细胞的双向分化潜力。

肝干细胞可能有三种去向:(1)通过自我更新,生成新的干细胞;(2)分化或演变为肝细胞、胆管细胞;(3)肝干细胞和肝癌细胞具有相同的肝脏微环境,在肝癌的模型和临床病理中发现癌组织和癌旁组织含有肝干细胞。

研究提示,分化程序错误可能诱发肝癌,也就是说肝癌细胞来源于肝干细胞。

新近研究发现wnt信号途径不仅调控干细胞增殖、分化,也调控癌干细胞(cancer stem cells,CSC)的增殖与分化。

尽管wnt信号和肝干细胞如此重要的作用,但是肝干细胞是否存在wnt信号途径的作用很少有人进行研究,肝癌细胞浆和胞核β-catenin表达及分布目前的免疫组化检测方法也不准确,很少有人对比性研究肝干细胞和肝癌细胞β-catenin表达和诱导分化方面的差异。

因此,我们研究了肝干细胞和肝癌细胞β-catenin表达,细胞内分布和诱导分化条件下两种细胞形态、生长曲线、细胞分泌白蛋白和AFP功能及β-catenin分布的差异,探讨wnt信号在肝干细胞分化与增殖,肝癌细胞增殖作用的差异性。

目的: 1.摸索较为经济实用的肝干细胞的分离培养及鉴定分析方法。

通过建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型,采用胶原酶消化法分离卵圆细胞,再经过Percoll密度梯度离心纯化,分离出肝卵圆细胞。

进行培养和肝干细胞标志物鉴定,期望得到下步试验所需要的肝干细胞,进一步研究肝干细胞定向诱导向肝细胞和胆管细胞分化的细胞形态学变化规律。

2.通过对wnt信号途径的关键分子β-catenin在肝干细胞和肝癌细胞的表达及细胞内分布的比较,研究wnt信号在肝干细胞和肝癌细胞分布的差异及其对细胞增殖、分化作用的关系。

证实wnt信号途径对肝卵圆细胞增殖及分化的调控作用。

3.通过肝干细胞和肝癌细胞在诱导分化前后细胞形态、生长曲线、细胞分泌白蛋白和AFP功能变化,及β-catenin分布的差异比较,研究β-catenin在肝干细胞和肝癌细胞增殖和分化中发挥的作用。

方法: 用AAF/PH建立了大鼠肝卵圆细胞增殖模型,用胶原酶消化法自大鼠AAF/PH模型中分离单个肝卵圆细胞,经过Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞悬液,细胞悬液接种于0.2%明胶处理的含10%胎牛血清和含SCF 20ng/ml,HGF 10ng/ml,EGF 10ng/ml,LIF 10n妙ml的DMEM/F12培养液的培养瓶进行增殖培养。

新分离的肝卵圆细胞用免疫荧光和Western Blotting检测c-kit干细胞抗原,RT-PCR法检测其CK19和白蛋白抗原,对肝卵圆细胞进行鉴定。

采用免疫细胞化学,免疫组织化学和Western Blotting技术检测β-catenin在肝干细胞和肝癌细胞的表达及其细胞膜、细胞浆和细胞核分布,比较肝干细胞和肝癌细胞表达和细胞内分布的差异性。

用含生长因子SCF 20ng/ml,HGF10ng/ml,EGF 10n妙ml,地塞米松1.0×10~(-7)mol/L,1.5%DMSO,HSS 20n妙ml的诱导培养液对进行肝干细胞及肝癌细胞株的诱导分化,观察诱导分化前后两种细胞形态变化和β-catenin表达和细胞表达及分布的变化。

结果: 1.成功制造了大鼠AAF/PH肝卵圆细胞增殖模型,部分肝切除手术后11～12d取肝,经过胶原酶IV消化肝组织和Percoll梯度离心肝细胞悬液等相对简单的方法提纯肝卵圆细胞,所得细胞存活率90%,细胞数1.0×10~5～1.0×10~6/ml。