胶体金免疫技术
免疫胶体金技术及其在兽医临床上的应用
X u m u s h o u y i免疫胶体金技术是一种全新的免疫标记方式，有着方便、成本低、应用范围广等多方面使用优势。
这一技术在20世纪80年代发展，随着其发展近年来在生物医学的不同领域中得到充分的应用，特别是在兽医领域中得到足够的发展。
免疫胶体金凭借着自身的精准性高、操作简单等特点在兽医临床中应用，可以在很短的时间内实现对畜禽疫病的有效判断，可提升禽畜疫情防控的成效。
一、免疫胶体金技术概述1、基本原理在具体的应用中，免疫胶体金主要是通过胶体金作为示踪的标注物，在抗原抗体的反应中实际使用。
氯金酸在还原剂的作用下渐渐的变为金颗粒，成为疏水胶溶剂，会带有负电荷。
在弱碱环境中，胶体金有着负电荷，动物体内则有着正电荷基团，将此二者结合后不会对蛋白质原本的生物特性造成影响。
而且，胶体金离子会对蛋白质的分子形成一定的吸附功效，可在临床疫病的检测中有效应用。
2、检测技术一般情况下，常常使用的检测技术有CGEIA、DIGFA这两种方法。
此两种方式的相同点是，在抗原或者是抗体中加入适量的需要检验的标本，在渗滤作用下，两者会结合，再通过胶体金标记。
DIGFA应用中，会将蛋白质吸附，加快免疫速度，也使颜色转变更加明显。
CGEIA在实际应用中，要通过免疫层析条，依照一定的顺序粘贴，并切成条状检测。
3、使用优点这一技术在实际使用中有着多方面优势。
具体来讲，在使用上方便且高效，可以在基础或者是现场等环境中使用，其所有呈现的反应都能够维持在15分钟之内。
使用的费用不高，此技术在应用中不需要购买特殊或者是贵重的相关仪器。
应用的范围也很广泛，能够满足各种检测的条件。
还可以开展多项内容的测试，将样品的应用率提高，在保证成本大幅度降低的同时，也能有效解决部分样品难以获取的难题。
这项技术的标记物性质也很稳定，保留的时间很长，而且保存所需条件也不多。
二、免疫胶体金技术在兽医临床上的应用1、在禽类临床上应用禽类产品的质量将直接影响人们的身体健康，若是禽类产品出现疾病，造成的危害是不可估量的。
免疫胶体金技术
The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing. Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size . The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.
. 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大
How are the antibodies coupled to the gold?
Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena : a). ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protein b). hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface c). Sulfur binding (Cysteine and Methionine)
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.
胶体金免疫层析技术原理
胶体金免疫层析技术原理胶体金免疫层析技术是一种基于胶体金颗粒的分析方法，常用于生物医学领域的分子检测和诊断。
该技术的原理是利用胶体金颗粒与特定抗原或抗体的高度特异性结合能力，通过可视化或仪器测量的方式实现目标分子的定量或定性分析。
胶体金是一种具有特殊光学性质的纳米材料，其颗粒大小一般在10-100纳米之间。
这种材料具有高度的稳定性和生物相容性，并且在可见光范围内具有强烈的吸收和散射光谱特性。
在胶体金免疫层析技术中，胶体金颗粒表面通常被修饰上特定的抗原或抗体。
在分析过程中，样品中的目标分子与胶体金颗粒表面的抗体结合形成复合物。
这种结合通常是由于抗原与抗体之间的特异性配对引起的。
复合物的形成会导致胶体金颗粒的聚集或分散状态发生变化。
胶体金免疫层析技术通常采用纸条或膜作为载体。
样品在载体上流动时，复合物会在特定位置停留，形成可见的信号线。
这个信号线的强度与目标分子的浓度成正比。
通过测量信号线的长度、颜色强度或使用专门的仪器分析，可以确定目标分子的存在与否以及其浓度。
胶体金免疫层析技术具有以下优点：1. 高度特异性：由于抗原与抗体之间的高度特异性结合，胶体金免疫层析技术可以准确地检测目标分子，避免了其他杂质的干扰。
2. 灵敏度高：胶体金颗粒具有强烈的吸收和散射光谱特性，使得该技术能够检测到非常低浓度的目标分子。
3. 快速简便：胶体金免疫层析技术通常只需要几分钟到几小时的时间完成分析，操作简单，不需要复杂的仪器设备。
4. 可视化结果：该技术可以通过肉眼观察或简单的仪器测量获得结果，无需复杂的数据处理。
胶体金免疫层析技术在临床诊断、食品安全监测、环境污染检测等领域具有广泛应用。
例如，在临床诊断中，可以利用该技术检测血液中的肿瘤标志物、病原体和药物残留等；在食品安全监测中，可以检测食品中的致病菌和有害物质；在环境污染检测中，可以检测水体、土壤和大气中的污染物。
胶体金免疫层析技术是一种快速、准确、简便且可视化的分析方法。
胶体金免疫层析技术原理
胶体金免疫层析技术原理介绍胶体金免疫层析技术（Colloidal Gold Immunochromatography Test）是一种常用于快速、便捷地检测生物体内特定分子的方法。
该技术基于免疫层析原理，利用胶体金颗粒作为信号指示剂，实现对目标分子的高灵敏检测。
原理胶体金免疫层析技术主要依赖于抗原-抗体的专一性识别和相互结合。
当胶体金颗粒与特异性抗体结合后，形成颗粒/抗体/抗原复合体。
通过将样品与含有抗原的试剂盒进行反应，可使目标分子与胶体金颗粒上的特异性抗体结合，形成颗粒/抗体/抗原/目标分子复合体。
操作步骤使用胶体金免疫层析技术进行检测通常需要以下步骤：1.样品处理–收集待测样品，并进行必要的前处理，例如离心、稀释等。
–如果样品是固体，需要先进行溶解或悬浊处理。
2.反应溶液的制备–根据试剂盒的说明书，将试剂溶解或稀释到适当的浓度。
3.准备试剂盒–打开试剂盒包装，并将提供的试剂按照指示加入到试剂盒中。
4.加样–使用专用的吸管或滴管，将处理好的样品滴入试剂盒的样品孔中。
5.反应–让样品与试剂盒中的抗体共反应一定时间，通常为几分钟。
6.拍照解读–将试剂盒放置在专门的解读器上，并对结果进行解读。
–解读器会对胶体金颗粒的颜色进行分析和判断，从而得出检测结果。
7.结果判读–根据解读器显示的结果，确定样品中目标分子的存在与否。
–通常，胶体金免疫层析技术结果可分为阴性、阳性或无效，具体判读标准需根据试剂盒说明书确定。
优势和应用领域胶体金免疫层析技术具有以下优势和应用领域：1.快速：检测时间短，通常在几分钟内可以得出结果。
2.简便：操作简单，无需复杂的设备和专业技术人员。
3.准确：具备高灵敏性和特异性，可以有效地识别目标分子。
4.可视化：结果直接显示在试剂盒上，无需显微镜等设备。
5.应用广泛：可以用于临床医学、环境检测、食品安全等多个领域。
局限性和发展趋势胶体金免疫层析技术虽然具有许多优点，但也存在一些局限性：1.灵敏度限制：相比于其他方法，如PCR和ELISA，胶体金免疫层析技术的灵敏度相对较低。
《免疫胶体金技术》课件
简便操作
免疫胶体金技术操作简便，不需要复 杂的仪器和设备，降低了对实验条件 和技术的要求。
VS
该技术适用于基层医疗机构、实验室 及家庭自测等多种场景，方便快捷， 易于推广应用。
稳定性好
免疫胶体金技术稳定性好，试剂有效期长，可长时间保存，保证了检测结果的稳定性和可靠性。
《免疫胶体金技术》PPT课件
目 录
• 免疫胶体金技术概述 • 免疫胶体金技术的制备 • 免疫胶体金技术的特点与优势 • 免疫胶体金技术的应用实例 • 免疫胶体金技术的挑战与前景
01
免疫胶体金技术概述
定义与原理
总结词
简述免疫胶体金技术的定义和基本原理。
详细描述
免疫胶体金技术是一种基于胶体金标记的免疫分析方法，利用胶体金作为示踪标记物，结合抗原抗体反应进行检 测和定量分析。其原理基于抗原抗体反应的特异性和胶体金的颜色变化，实现对目标物质的快速、灵敏和可视化 检测。
组装质控线
在硝酸纤维素膜上固定另一种 抗原或抗体，形成质控线。
组装试剂条
将硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸 和吸水纸按顺序粘贴成试剂条
。
质量检测与控制
外观检查
观察试剂条是否平整、无破损、颜色均匀。
稳定性检测
在不同温度和湿度条件下存放试剂条，观察 其稳定性。
性能测试
通过与已知浓度的标准品进行对比，检测试 剂条的灵敏度和特异性。
历史与发展
总结词
概述免疫胶体金技术的发展历程和重要突破。
详细描述
免疫胶体金技术最早可追溯到20世纪70年代，随着科学家对胶体金和免疫学研究的深入，该技术逐渐 发展成熟。近年来，免疫胶体金技术不断取得突破，在临床诊断、生物安全检测、食品安全检测等领 域得到广泛应用。
免疫胶体金的技术
2. 凝胶过滤法
u 将探针溶液装入透析袋内， 4℃ ，置于硅胶或聚乙 二醇中浓缩至原体积的1 4～1 5 u 离心 1500 r min，20min 弃沉淀 u 经Sephacryl（丙烯葡聚糖）S400层析柱分离纯化。 用0.02mol/L TBS(0.1%BSA)洗脱 ? TBS的PH根据蛋白质种类而定 u 按红色深浅分管收集洗脱液
1. 光镜免疫金银法 3 在免疫金染色的基础上增加物理显影的步骤 3 显影液的配制及显影过程应在暗处进行 3 阳性部位呈黑色颗粒状 32. 电镜免疫金银法 3 包埋前染色, 包埋后染色
【IGSS法优点】
1. 可被用于光镜和电镜观察 2. 敏感性高 3. 定位准确 4. 背景清晰, 对比度好 5. 方法简便, 安全 6. 成本较低, 标本可长期保存
【常用还原剂】柠檬酸钠、鞣酸、白磷等
柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，15~150nm
白磷还原制备的金颗粒直径较小，3~12nm
【具体制备方法】
（二）影响溶胶稳定性的因素 u 电解质 u 胶体金浓度 u 温度 u 大分子物质
（三）胶体金的鉴定
【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小 及金颗粒的均匀程度
( 七) 标记探针的鉴定
1. 负染色检查: 将胶体金溶液滴在覆有
Formavar膜( 支持膜) 的镍网上, 空气中干燥, 醋 酸铀负染, 透射电镜下观察
2. 生物活性鉴定: 可用直接或间接法放射免疫
测定, 凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定
四. 免疫胶体金染色方法
( 一 ) 免疫金染色法
Immunogold staining, IGS
( 五）标记
1. 计算所需待标记蛋白质的总量
根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最 适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量
胶体金免疫标记技术
胶体金免疫标记技术胶体金免疫标记技术一、胶体金的制备一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm 范围内。
范围内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
使用不同种类、使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。
即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。
还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。
但体积也越小。
但体积也越小。
粒子直径每增加一倍，数量减少为粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm 的胶体金。
因此一般胶体金探针均使用该方法进行。
但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
此时在溶液中添加此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。
双标记或制备5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。
的胶体金时建议使用该方法。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm 直径的胶体金。
但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。
因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 12-16 nmnm 直径的胶体金。
金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法故该方法已经很少使用。
已经很少使用。
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或1g ），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 1.5 ml ml 试管分装为1 1 ml ml 保存（-20℃）。
免疫胶体金技术原理
免疫胶体金技术原理
免疫胶体金技术是一种基于胶体金纳米颗粒的免疫学方法，被广泛用于生物医学研究
与临床诊断。
其原理是利用胶体金颗粒的特殊性质和免疫学反应的特异性，通过抗原-抗
体相互作用将胶体金颗粒定向固定在目标分子表面，从而实现对目标分子的定性定量检
测。
制备胶体金颗粒。
胶体金颗粒具有纳米级尺寸，呈现酒红色溶液。
制备过程中，通过
还原剂将金盐还原成纳米级金粒子，同时通过表面修饰分子对金颗粒进行稳定处理，使其
分散在溶液中且具有良好的分散性和稳定性。
接下来，制备抗原-抗体复合物。
抗原是待检测的分子，抗体是针对抗原的特异性免
疫反应产物。
在一般的实验中，抗原与抗体分别与胶体金颗粒进行孵育，使其发生特异性
结合。
抗原-抗体复合物的形成在一定程度上改变了胶体金颗粒的表面性质，导致颗粒之
间出现簇集或聚集现象。
通过观察胶体金颗粒的聚集程度来评估目标分子的存在量。
胶体金颗粒在溶液中呈现
酒红色散乱光谱，其最大吸收峰位于520-550nm。
当胶体金颗粒与抗原-抗体复合物结合后，由于胶体金颗粒的聚集导致溶液呈现紫色，吸收峰会发生红移和增强。
利用紫外-可见吸
收光谱仪等仪器可以测量和分析胶体金溶液的吸收光谱，从而可定性和定量地获得目标分
子的存在量。
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2.竞争法
•抗体的检测一般不采用竞争法。 •抗体的竞争法测定不同于单个抗原决定簇的小分 子抗原的竞争法。 •测定可靠性受竞争抗体的特异性和亲和力影响。 亲和力的差异易造成部分无法解释的结果。
待测Ab
HBeAb竞争法（改良）
固相Ag
酶标Ab E
HBeAb竞争法（传统）
显色强弱与 待测含量呈反比
待测Ab
非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定(ELISA)
1、均相酶免疫分析技术
均相酶免疫分析又叫勿需分离的酶 免疫分析，酶标抗原与抗体结合后，其 中的酶活性将被减弱或增强，因此不需 分离即可测定反应系统中酶活性的变化， 从而推算出待测物的含量。
酶增强免疫测定技术示意图（EMIT）
标本抗原
EMIT的基本原理及特点： 半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。 当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触， 使酶的活性中心受到影响而活性被抑制（图A）。 从酶活性的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。 标本抗原浓度与显色程度成正比。
中和Ag
E 酶标Ab
固相Ab
中和Ag
E 酶标Ab
4. 捕获法测IgM抗体
• 血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性 IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定
• 捕获法：先将所有血清IgM（包括特异性 IgM和非特异性IgM）固定在固相上，再测 定特异性IgM。
捕获法测IgM抗体示意图
RF的干扰
检测抗原的方法
1. 双抗体夹心法
顾名思义，由两个抗体夹一个抗 原形成“三明治”复合物，来检测抗 原的方法，仅适合于至少含两个抗原 决定簇的多价抗原检测。
固相 抗体
固相载体
待测抗原
E 酶标
抗体
1. 抗体（检测抗原） 2.加样本、孵育、洗涤 3.加酶结合物、孵育、洗涤 4.加底物液、终止液、比色
EE EE
双位点一步法测抗原示意图
钩状效应（hook effect） 当标本中待测抗原浓度相当高时，过量 抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不 再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含 量，严重时甚至可出现假阴性结果。（类似 于沉淀反应中抗原过剩的后带现象）
应用
如：乙型肝炎表面抗原的检测（HBsAg）
3. 竞争法
试剂制备 反应条件的选择 操作的标准化
1. 试剂制备
（1）抗原和抗体的选择 （2）固相载体选择 （3）酶的选择及标记过程 （4）底物 （5）终止液
★ （1）抗原和抗体
酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjugate) 要求： • 抗原纯度高、抗原性完整 • 抗体特异性好,效价高,亲和力强,比活性高 • 用于ELISA的抗体有多克隆和单克隆，效果
第五课（第一部分） 酶免疫技术
酶免疫技术特点 ELISA 的原理和类型 ELISA 的技术要点
一、酶免疫技术的定义和特点
以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，利 用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特 异性抗原-抗体免疫学反应检测的敏感性的 一种标记分析技术，称为酶免疫技术 （enzyme immunoassay，EIA）
BAS-ELISA法示意图
待检标本
应用
由于BAS-ELISA法的放大作用， 可对体内含量极微的物质进行检测， 例如：细胞因子、粘附分子等的检测。
不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计 ELISA方法可有所不同，但都是在以上几种经典方法 的衍化和变通。
三、ELISA 的技术要点
ELISA技术要点包括三个方面：
检测抗原
阴性
阳性
底物液、终止液
Colorless OD
浓度
应用：
如：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、细胞 因子、肿瘤标志物AFP、CEA等的测定
2. 双位点一步法
在双抗体夹心法的基础上发展而 来，所检测抗原有两个不同的抗原决 定簇，两种针对不同抗原决定簇的单 克隆抗体可同时和抗原反应，生成夹 心式“三明治”复合物。
（一）ELISA的基本原理以检测抗原为：固相抗体待测抗原
E 酶标抗体
固相载体 ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay(酶联免疫吸附试验)
（二） 方法类型
检测抗原的方法
1. 双抗体夹心法 2. 双位点一步法 3. 竞争法
检测抗体的方法
1. 间接法
2. 双抗原夹心法 3. 竞争法
应用：
• 主要用于检测小分子激素和半抗原 （如：药物）
2、异相酶免疫分析技术
异相酶免疫分析要求，酶标抗原与 抗体结合后，需采用适当的方法分离游 离的和抗原（或抗体）结合复合物-酶标 记物，测定底物显色程度，从而推算出 待测物的含量。
异相液相酶免疫分析 固相酶免疫分析——ELISA
3、ELISA 的原理和类型
2. Sample (human antibody ) 1. Antigen coating
E EE
附：
国际通用的标准板形是8X12的96孔式
附： 酶标仪图
吸光度与抗体浓度标准曲线
OD值
[antibody]
优点
只要更换不同的固相抗原， 用一种酶标抗抗体就可检测出各 种相应的抗体。
应用
人体内多种自身抗体检测，如： 抗CCP抗体、抗心磷脂抗体等
测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞 争与固相抗体结合，因此结合于固 相的酶标抗原量与受检抗原的量呈 反比。
AgE+Ab AgEAb + Ag
AgAb
竞争法示意图
检测抗体的方法
1. 间接法测抗体
所谓间接法是指利用酶标记 的抗抗体（即二抗）来检测与 固相抗原结合的抗体。
间接法检测抗体示意图
5.Stop solution 4. Substrate 3. Anti-(human) Ig-enzyme
酶免疫技术一般由两部分组成：
1. 抗原+抗体 IC（酶标抗原或抗体参与）
2. 底物
抗体或抗原上的酶 显色
色泽程度与IC中的酶活性及数量相关，
颜色深浅可确定待测抗原或抗体存在或含量
特点: 免疫反应的高特异性 酶(专一性)催化反应的高效性及高灵敏度
二、酶免疫技术的分类
酶免疫组化技术 酶免疫测定技术
均相酶免疫测定 液相酶免疫测定
捕获法测 IgM抗体 实际上夹 心法的两 次运用
应用：如：检测乙肝IgM型抗体
6. BAS-ELISA（参见相关章节）
生物素亲合素-ELISA
亲合素：Avidin 生物素：Biotin
System
• 1个亲合素可以和4个生物素分子亲密结合，虽 不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，一经结 合就极为稳定。 • 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大 大提高ELISA的敏感度。