大肠杆菌的冷冻干燥保存
冻干保藏技术
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5、预冻
• 菌株一般在-20℃条件下预冻24h • 病毒在-70℃预冻24h
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10、复苏方法：
• 先用70%酒精棉花擦拭冻菌管尤其是中部； • 将冻菌管顶部在酒精灯外焰灼烧；
• 用砂轮在中部划开。
• 用培养液溶解菌块，无菌吸管吹匀，无菌操作玻尔环沾取
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6、冷冻干燥
• 采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。 • 将冷冻后的样品冻菌管置于冷冻干燥机的干燥箱内， 开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。 • 终止干燥时间应根据下列情况判断： a 冻菌管内冻干物呈酥块状或松散片状 b 真空度接近空载时的最高值 c 样品温度与管外温度接近 • 冷冻干燥完毕后，取出样品冻菌管置于干燥器内，备 用。
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2、保护剂的选择和准备 • 保护剂种类要根据微生物类别选择。菌种/毒种冻存选 用蔗糖脱脂奶。 • 蔗糖是一种耐热冻干保护剂，在冻结和干燥过程中， 可防止活性组分变性； • 脱脂奶粉可促进升华。
菌液在培养基平板上三区划线，或直接取部分菌液滴在新
XL1-Blue 大肠杆菌菌株使用说明
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
注 意 事 项 ：
1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放
置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能
核酸内切酶系统缺失，增强了外源 DNA 的稳定性和提取质量。 lacIqZΔM15
的存在使 XL2-‐Blue 菌株可用于蓝、白斑筛选。对 XL1-‐Blue 使用 LB，在 37℃
有 氧 的 环 境 下 培 养 ， 42℃热 激 处 理 可 将 质 粒 成 功 转 入 XL1-‐Blue 中 。
laclqZΔM15 Tn10 (Tet')]
简 介 ：
XL1-‐Blue 菌株能保证高拷贝质粒稳定复制，recA1 和 endA1 的突变有
利于插入 DNA 的稳定和高纯度质粒 DNA 的提取。hsdR17 突变导致 EcoK
进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻管中。
轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。
进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
常用大肠杆菌基础信息及使用说明
常用大肠杆菌基础信息及使用说明常用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌群中的细菌，是一种革兰氏阴性菌，属于革兰氏阴性杆菌属中的大肠杆菌（Escherichia）属。
大肠杆菌长约2微米，呈棒状，通常是无运动的。
它是一种兼性厌氧菌，能够以不同的环境条件生存。
大肠杆菌广泛存在于自然界中，特别是动物的肠道中。
在人类肠道中，大肠杆菌具有重要的生理功能，保护肠道免受其他有害菌的侵袭，并参与食物消化和维持肠道的健康。
同时，大肠杆菌还对环境具有重要的指示作用，可作为一种指示性微生物来监测水质和食品的卫生状况。
大肠杆菌常用于实验室中的分子生物学研究和基因工程技术中。
它具有以下特点和优势：1.遗传稳定性：大肠杆菌具有较高的遗传稳定性和可操作性，其基因组较小、结构简单，易于研究和改造。
3.快速生长：大肠杆菌具有较快的生长速度，培养时间相对较短，便于实验操作和快速筛选。
4.易于培养和保存：大肠杆菌在实验室中培养相对简单，可通过液体培养和固体培养来获得足够的菌量。
同时，大肠杆菌具有较强的抗冷冻和抗干燥能力，便于保存和共享。
然而，使用大肠杆菌也存在一些注意事项和使用技巧：1.选择合适的菌株：根据实验需求选择不同的大肠杆菌菌株，如常见的DH5α、BL21等。
不同菌株具有不同的特性和表达系统，需根据实验目的进行选择。
2.处理菌株的遗传背景：大肠杆菌具有多样的遗传背景，可能会影响实验结果。
在进行基因表达、突变和克隆等实验时，需注意背景的一致性和对结果的可能影响。
3.增殖条件的优化：大肠杆菌对培养条件较为敏感。
在进行实验前，需对培养基、温度、pH值等条件进行优化，以获得最佳的菌落增殖情况。
4.严格控制污染：大肠杆菌在实验过程中容易受到其他菌株的污染，需进行严格的无菌操作，避免影响实验结果。
5.安全操作：大肠杆菌是一种被认为是相对安全的微生物，但仍需要注意避免直接暴露和接触，使用时应佩戴手套和实验室级别的防护措施。
微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏
国家自然科技资源平台微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组二〇〇四年十二月十日目次前言 (2)引言 (3)1范围 (4)2规范性引用文件 (4)3术语和定义 (4)4内容 (5)参考文献 (10)1前言本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。
本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。
本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。
引言微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。
微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程1 范围本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。
本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。
对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》GB 19489 实验室生物安全通用要求科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件自然科技资源共性描述规范（试行）3 术语和定义下列术语和定义适用于本规范。
3.1冷冻干燥 freeze-drying将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
菌种保存大家谈。甘油的浓度。
菌种保存大家谈。
甘油的浓度。
2009-08-15 01:13大家好！我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。
因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项?甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
不适合酷友频繁的求助菌种。
我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。
就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。
菌种的保存方法实训报告
一、实训目的通过本次实训，了解和掌握菌种保存的基本原理和方法，提高实验室菌种保存技能，为后续的微生物学研究和工作打下基础。
二、实训时间2021年X月X日三、实训地点微生物实验室四、实训材料1. 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）2. 培养基：营养琼脂、沙土管、液体石蜡、无菌甘油、冷冻干燥机、低温冰箱、高压蒸汽灭菌器、无菌操作台等五、实训内容1. 斜面低温保藏法（1）将菌种接种于营养琼脂斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
（2）待菌落生长充分后，用无菌接种环挑取单菌落，接种于新的营养琼脂斜面培养基上。
（3）将斜面培养基放入2-8℃低温冰箱中保存。
2. 液体石蜡覆盖保藏法（1）将菌种接种于营养琼脂斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
（2）待菌落生长充分后，用无菌接种环挑取单菌落，接种于新的营养琼脂斜面培养基上。
（3）将灭菌后的液体石蜡倒入无菌试管中，使液面高出斜面顶端1cm。
（4）将斜面培养基插入液体石蜡中，确保菌落被液体石蜡完全覆盖。
（5）将试管直立，置于4℃低温冰箱中保存。
3. 沙土管保藏法（1）将培养好的菌种接种于无菌沙土管中，加入适量的无菌沙土，搅拌均匀。
（2）将沙土管置于干燥器中，抽真空至干燥。
（3）密封沙土管，置于4℃低温冰箱中保存。
4. 甘油管保藏法（1）将菌种接种于营养琼脂斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
（2）待菌落生长充分后，用无菌接种环挑取单菌落，接种于新的营养琼脂斜面培养基上。
（3）将无菌甘油加入试管中，使其浓度为30%。
（4）将菌种与甘油充分混合均匀。
（5）将混合液置于-20℃低温冰箱中保存。
5. 冷冻干燥保藏法（1）将菌种接种于营养琼脂斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
（2）待菌落生长充分后，用无菌接种环挑取单菌落，接种于新的营养琼脂斜面培养基上。
最新微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏
1.1.1.1.1.2微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏国家自然科技资源平台微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组二〇〇四年十二月十日目次目次 (1)前言 (2)引言 (3)1 范围 (4)2 规范性引用文件 (4)3 术语和定义 (4)4 内容 (5)参考文献 (10)前言本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。
本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。
本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。
引言微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。
微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程1 范围本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。
本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。
对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》GB 19489 实验室生物安全通用要求科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件自然科技资源共性描述规范（试行）3 术语和定义下列术语和定义适用于本规范。
3.1冷冻干燥 freeze-drying将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
TransB 大肠杆菌菌株使用说明
正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来
电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧
状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促
储存温度：-‐80℃
简 介 ：
类别： 大肠杆菌克隆菌
培养基： LB
诱导方式： IPTG
培养方式： 37℃，有氧
保存方式 ： 30%甘油，-‐80℃
质粒转化方法： 42 ℃热激
操作说明：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻管中。
轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。做好标识，在适宜温度下培养。
TransB 大肠杆菌菌株
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00600
TransB 大肠杆菌菌株
基 本 信 息 ：
名称：TransB 大肠杆菌菌株
规格：300ul 甘油菌
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
注 意 事 项 ：
1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放
置会导致菌种衰退；
2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；
3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能
进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
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步骤：
1各种物品的准备与高温蒸汽灭菌
2 菌种的培养:LB液体培养基24h
3离心
4有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
5真空冷冻干燥。
大肠杆菌的冷冻真空干燥法
【试剂与器材】1．菌种: 保存的大肠杆菌
2．培养基：LB液体培养基
3．溶液或试剂:脱脂奶粉
4．仪器或其他用具1ml枪头、无菌滴管，冻干管（青霉素瓶），普通冰箱，低温冰箱(-30℃)、离心机、离心管、锥形瓶、试管、灭菌锅、烘干箱等。
【操作步骤】
1．准备冻干管：青霉素瓶（5ml）用蒸馏水冲洗1～2次，加四层纱布封口后，121℃灭菌30min备用。
配制保护剂：将脱脂奶粉配成10%乳液, 115℃，灭菌10min,随机抽样进行无菌检查,确认无菌后方可使用。
2．培养菌种：将要保存的菌种接入LB斜面培养基中，36±1℃培养24h后，镜检后转接LB液体培养基36±1℃培养24h。
3．离心（细胞收集）：将长好菌的液体培养基分装灭过菌的离心管，6000r/min离心10min。
4. 加保护液：每100ml 培养基离心出的细胞加入5-10ml 保护液混匀。
5、分装样品：用灭过菌的1ml枪头吸取加过菌的保护剂，注入到冻干管中（2mL）。
6．预冻：将加好保护剂的冻干管盖上胶盖封上纱布放于饭盒中，置于-30℃冰柜冷冻24h-48h 即可。
7．冷冻真空干燥: 启动冷冻真空干燥机制冷系统。
当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的样品在无菌条件下打开胶盖（不拿下来，留一个缝隙即可）封好纱布，迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥（约24h）。
8．取出样品：先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。
先取几只冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散．说明干燥程度达到要求。
若用力颠，样品不与内壁脱开，也不松散，则需继续冷冻真空干燥，此时样品不需事先预冻。
9. 熔封用高频电火花真空检测仪检测冻干管内的真空程度。
当检测仪将要触及冻干管时，发出蓝色电光说明管内的真空度很好，便在火焰下(氧气与煤气混合调节，或用酒精喷灯)熔封冻干管。
（青霉素瓶不用这步）
10. 检测存活性每个菌株取1支冻干管及时进行存活检测。
打开冻干管，加入0.2m1无菌水，用毛细滴管吹打几次，沉淀物溶解后(丝状真菌、酵母菌则需要置室温平衡30 min～60min)，转入适宜的培养基培养，根据生长状况确定其存活性，或用平板计数法或死活染色方法确定存活率,如需要可测定其特性。
11．保存置4℃或室温保存(前者为宜)。
隔时进行检测。
12．取用冻干管时，先用75％乙醇将冻干管外壁擦干净，再用砂轮或锉刀在冻干管上端画
一小痕迹，然后将所画之处向外，两手握住冻干管的上下两端,稍向外用力便可打开冻干管，或将冻干管近口烧热，在热处滴几滴水，使之破裂，再用镊子敲开。
【注意事项】样品干燥的程度对菌种保存的时间影响很大。
一般要求样品的含水量为1%～3%，判断方法：外观样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象，对照管完全干燥；指示剂用30g/L的氯化钴水溶液分装冻干管，当溶液的颜色由红变浅蓝后，再抽同样长的时间即可。
将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
操作步骤如下：
好氧菌冷冻干燥管的制备
• 1 安瓿管准备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。
清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
• 2 保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。
配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。
如血清，可用过滤灭菌；
牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
• 3 冻干样品的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。
微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。
采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。
若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。
分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌条件下操作。
• 4 预冻一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。
• 5 冷冻干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
• 6 真空封口及真空检验将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
•7 保藏安瓿管应低温避光保藏。
•8 质量检查冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
•厌氧菌冷冻干燥管的制备
•主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100℃的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。
•复苏方法
•——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。