大肠杆菌的分离和培养
实验1-大肠杆菌的培养与分离
原核生物界
真菌
真菌界
原生动物 原生生物界
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光 学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结 构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
细菌的外形与大小
大肠杆菌属于杆状菌
细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分 为两大营养类型。
自养菌:
二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续 划线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
（五）大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形 的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、 高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的 芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随 风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽 孢又可以萌发，形成一个细菌.
【课堂练习】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计实验目的：1. 掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
3. 培养和分离大肠杆菌是许多生物技术实验的基础，通过本实验的学习，同学们可以更好地开展相关生物技术实验工作。
实验原理：大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，在微生物学及相关学科的研究中具有重要意义。
为了能够更好地开展生物技术实验，需要掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
在培养大肠杆菌时，我们一般选用LB培养基（Luria-Bertani培养基），它是一种营养丰富的培养基，可以满足大肠杆菌的营养需求。
在制备LB培养基时，需将适量的蛋白胨、酵母提取液和纯化水混合均匀后加热至沸腾约1分钟，然后加入适量琼脂糖，搅拌均匀后装入烧瓶中。
分离纯化大肠杆菌时，需要将样品（如肠道内容物、污水等）进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围，然后在LB培养基上进行平板培养。
在培养过程中，需要控制培养温度、时间和氧气浓度等因素，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。
随着时间的推移，大肠杆菌会在平板上生长成大量的细菌菌落，此时，我们可以将单个细菌菌落挑选出来进行分离纯化，以得到单一纯化的大肠杆菌。
实验材料与仪器：材料：LB培养基、螺旋细胞均一器、平板培养基、霉菌试验纸、吸管、医用酒精、胶体金离子分离剂等仪器：高压灭菌器、移液管、显微镜、细胞计数板实验步骤：1. 制备LB培养基。
2. 取样和稀释。
取样品（如肠道内容物、污水等），取适量于吸管中，并将其进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围。
3. 平板培养。
将LB培养基倒入平板中，恰好覆盖平板的整个表面。
待培养基凝固后，使用螺旋细胞均一器将取样液均匀滴在培养基表面上。
将平板置于37℃恒温箱中，控制温度和氧气浓度等因素，待大肠杆菌细菌菌落生长到足够数量时，进入下一步。
4. 分离纯化。
将平板上的大肠杆菌细菌菌落挑选出来，使用吸管将细菌菌落转移到新的平板中进行分离纯化。
一般建议选择较小的细菌菌落进行挑选，这样可以减少细菌间的竞争，提高挑选单一菌株的成功率。
大肠杆菌培养和分离
大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。
1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。
消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。
实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。
分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。
1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。
一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。
细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。
实验1：大肠杆菌的培养和分离
天然培养基
(根据用途)：
全营养培养基：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
选择培养基：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基： 2、培养基的营养成分：
种 类 查氏培养基 成 分 NaNO3 0.3g 、 KCl 0.05g 、 K2HPO4 0.1g 、 FeSO4 0.001g 、MgSO4•7H2O 0.05g、蔗糖 3g 、 H2O 100g
麦芽汁培养基
干麦芽粉加四倍水
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
60~80℃烘 箱中烘干
•操作步骤： 加塞封口、包扎 —— 灭菌 ——烘干
•通常试管用棉塞(2/3在试管 内)，三角瓶用封口膜或纱布。 •作用：既通气又阻止杂菌进 入 •不能用脱脂棉(易吸水引起污 染)。 用牛 皮纸 或报 纸包 扎 •放入高压蒸汽灭菌锅, 在121℃(1Kg/cm2压 力)下灭菌15min。 •培养基中若有葡萄糖, 用500g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30min。 防止葡萄糖分解碳化 •不能加热灭菌的化合 物(如尿素)，只能用 G6玻璃砂漏斗过滤。 细菌不能滤过G6
灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
用于接种工具(接 种环、接种针)或 其他金属用具。
干热灭菌
160－170℃；1－2h 用于能耐高温的需要保持干燥 的物品(如玻璃器皿)。
高压蒸汽灭菌
121℃(1Kg/cm2压力)；15min 最常用。通常用于培养基及各种 器具的灭菌。
大肠杆菌的培养和分离
培养基种类
物理状态
• 液体培养基 • 固体培养基 • 半固体培养基
工业生产、 工业生产、连续培养 菌种分离、鉴定、计数 菌种分离、鉴定、 菌种保存
培养基种类
化学成分
• 合成培养基 • 天然培养基
菌种分类、鉴定 菌种分类、 工业生产降低成本
培养基种类
添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别
目的用途
•鉴别培养基 鉴别培养基 • 选择培养基
伊红—美蓝鉴别大肠杆菌 伊红 美蓝鉴别大肠杆菌
添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离
1：加抗生素，用于分离真核生物和原核生物 ：加抗生素， 2：加高浓度的食盐获取金黄色葡萄球菌 ： 3：缺N源，分离固氮微生物 ： 源 4：缺少有机C源，分离自养型微生物 ：缺少有机 源
消毒方法
2、对一些不耐高温的液体，使用巴氏消毒法（80℃中15min 、对一些不耐高温的液体，使用巴氏消毒法（ ℃ 或70 ℃中30min，实际生产中常用于鲜奶的消毒） ，实际生产中常用于鲜奶的消毒） 3、对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等 、对接种室、 溶液以增强消毒效果， 溶液以增强消毒效果，然后用紫外线进行物理消毒 4、双手使用酒精进行消毒 、
划线分离法
由接种环以无菌操作沾 取少许待分离的材料， 取少许待分离的材料， 在无菌平板表面进行平 行划线或其他形式的连 续划线， 续划线，微生物细胞数 量将随着划线次数的增 加而减少， 加而减少，并逐步分散 开来， 开来，如果划线适宜的 话，微生物能一一分散 经培养后， ，经培养后，可在平板 表面得到单菌落。 表面得到单菌落。 连续划线法 交叉划线法
包器材
包器材
灭菌
条件： 条件： 121℃、 121℃、100kPa 2020-30min
微生物的利用-大肠杆菌的培养与分离
实验原理
① 培养基 ② 大肠杆菌 ③ LB液体培养基和LB固体培养 基 ④ 划线分离法 ⑤ 菌种的低温保存 ⑥ 无菌技术
一、培养基定义及营养成分
1、定义 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长 繁殖的营养基质，称为培养基。 2、营养成分 培养基中的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源、生长 因子等
• 主要方法：无菌室 无菌柜 超净工作台
• ② 无菌实验器材： 凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须 灭菌。 • 如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培 养基、无菌衣 、口罩等，无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处 理，例如无菌室内的凳、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌， 但是可以消毒，可用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。
• 2、营养成分 • ① 碳源 • 为微生物提供碳元素的物质，可分为有机碳源和无机碳源 • 。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源； • 糖类、石油、花生粉饼等有机碳源，异养微生物只能利用有机碳 源；单质碳不能作为碳源。 • 注意：碳源&能源的辨析
• 2、营养成分 • ② 氮源 • 为微生物提供氮元素的物质，可分为有机氮源和无机氮源 • 。有机氮源包括牛肉膏，蛋白胨等， • 无机氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利 用 N2。
微生物的利用
1大肠杆菌的培养和分离 2分离以尿素为氮源的微生物
大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的 • 实验原理 • 实验器具与材料 • 实验步骤 • 实验结果和结论 • 知识拓展
实验目的
• 利用LB液体培养基进行大肠杆菌的扩增培养的操作 • 利用LB固体平面培养基划线培养进行大肠杆菌的分离 • 说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理
实验1大肠杆菌的培养和分离ppt课件
2、成分
水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子
(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)
不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方
调节pH
真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
四、无菌操作
1.无菌操作的概念
无菌操作杂泛菌指在培养微生物的操作中，所有防止________污染的方法。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下 一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的 增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ 为什么？
划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和 感染操作者。
大肠杆菌在人体的_____中一肠般道对人体无害，但任何 大大肠肠杆杆菌菌如是_果_进__入_____工__程__中_被__广_泌都泛尿会采系对用统人的体工产具生。危害。
基因
质粒、 EcoRⅠ限制酶、
E.coli-DNA连接酶、
受体细胞
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长 繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构 的子细胞群体。
天然培养基：
天然培养基有血清、 血浆、和组织提取液 （如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富， 培养效果好 缺点：来源受限;成分 复杂，影响对某些实 验产物的提取和实验 结果的分析;易发生支 原体污染;
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
主要包括：
_各__种__器__具__必须无菌、 __培__养__基___也必须要无菌、 ___________时不能带入其他杂菌
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问题2：在培养过程中如何进行维持无菌状态？ 消毒VS灭菌
较为温和的方法，如酒精
强烈，完全无菌
芽孢为细菌的休眠体， 对不良环境有很强耐受性
灭菌消毒技术是微生物有关工作中 最普通也是最重要的技术。
灭菌消毒技术大汇总 1、高压蒸汽灭菌法
1kg/cm2、121 ℃下维持15min. 0.5kg/cm2、90 ℃下维持30min.
大肠杆菌的培养和分离 微生物简单介绍 病毒 细菌 放线菌 真菌 原生生物
放线菌
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体（种群） • 菌落是鉴定菌种的重要依据
• 结构 • 异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)(G-) • 应用
问题1：用什么培养大肠杆菌？（稀释）涂布分离法1、玻璃刮刀放在酒精溶液中待用 2、取出时要经过灼烧 稀释10-5—10-7倍， 3、一般要稀释菌液进行培养 取0.1ml不同浓度的稀释液
4、大肠杆菌的培养和分离的过程
一 配制LB培养基,并灭菌 计算称量 溶解 调pH 分装 加塞，包扎 灭菌
二 倒平板、制斜面 三 大肠杆菌的培养 四 大肠杆菌的分离 使所需细菌大量繁殖 获得单菌落，纯化菌株
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4· 7H2O 葡萄糖 尿素
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10 g 1 g
琼脂
15 g
将上述物质溶解后，用 蒸馏水定容到100 mL
（ （ 1 ）此培养基能否用于植物组织培养？ ）下列材料或用具：①培养细菌用的培养基与培养皿， 4 ）转为固体培养基时，常采用 的 65 ）实验结束后，使用过的培养基应该进行 , （ ②玻棒、试管、锥形瓶和吸管，③实验操作者的双手。 2）培养基中加入尿素的目的是 处理后，才能倒掉。 其中需要灭菌的是： 筛选 ，这种培养基属于 ；需要消毒的是： 。 （3）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中 的 和 ，实验需要振荡培养，原因是
防止温度过高，葡萄糖分解碳化 。
2、灼烧灭菌法
接种环、接种针
玻璃刮刀
3、干热灭菌法
160-170 ℃下加热1-2h。
4、G6玻璃纱漏斗过滤法
5、其他 三角瓶用封口膜、超净台操作（含紫外灯、过滤风） 在接种时要速度快
3、如何分离大肠杆菌 划线分离法 （平板划线分离法） ①培养皿倒置 ②划线的末端 出现不连续的 单菌落
划线分离法（或涂布分离法） 五 斜面接种培养
目的菌株的纯培养和菌种保存
接种环（针） 接种 菌种管 接种在 固体培养基中
三角瓶（液体培养基）
实验2：分离以尿素为氮源的微生物
1.如何设计对照？ 2.如何把液体培养基配置成固体培养基？
3.如何完成菌液稀释？ 用什么液体来稀释菌液？ 4.用什么方法来分离这种微生物？ 5.该实验简单的设计思路是什么？
培养基。
• 按照微生物对营养物质的不同需求，配制出 供其生长繁殖的营养基质。
液体培养基
凝固剂 琼脂
扩大培养，工业生产
固体培养基
分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏
选择培养基 鉴定培养基 天然培养基 合成培养基
成分 碳源 氮源 无机盐
作用
主要作能源物质 合成含N类化合物 调节渗透压等
主要来源
无机碳(CO2) 或有机碳(糖类) N2，NH3，铵，硝酸盐 尿素，牛肉膏，蛋白胨
水
生长因子
调节促生长 维生素，Aa，碱基等
细菌中性偏碱，霉菌中性偏酸。
如鉴定分解尿素的细菌，在培养基中添加酚红， 产生红色反应。 LB液体培养基与LB固体培养基。
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物
例1、某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而 进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、 （1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养 提供了 和 。除此之外， 培养基还必须含有的基本成分是 和 （2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。 （4 20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同 3）培养 ）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了 的菌落，这说明湖水样品中有 种细菌。一般说 湖水样品的平板置于 中培养，培养的温度设定 来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越 在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另 （ 5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐 一平板上接种 细菌，这种培养基被称为 。