微生物 实验六

实验六
紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应及裂解性噬菌体效
价测定（12学时）
一、实验目的与要求：
•1、学习并掌握物理诱变——紫外射线诱变育种的方法。

•2、学习并掌握计算诱变后存活率及致死率的计算。

•3、学习透明圈和菌落直径大小及HC比值计算。

•4、学会裂解性噬菌体效价测定方法。

•5、学会抗生素效价测定方法及利用检定菌检测微生物代谢产物的抗菌性。

二、实验原理——诱变育种
1.诱变育种
以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。

诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。

诱变：物理、化学或生物诱变方法
紫外线的诱变育种：
紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。

一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。

被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个/ml。

由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。

由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

本次实验具体内容：紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应
筛选模型应用原理：枯草芽孢杆菌生长过程中产生胞外淀粉酶，将培养基中淀粉分解，根据产酶量的大小将其周围淀粉分解能力各不相同。

在菌长出后向平板人加碘液，在菌落周围将出现透明圈。

根据透明圈的直径可知道该菌落产生淀粉酶的能力。

操作步骤
1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

2．将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。

将菌液倒入
有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。

老师已经准备菌悬液
3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。

在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1min、2min、3min。

操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。

5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。

6．取中间培养液稀释分离、培养。

7．挑取菌落进行筛选。

实验准备器皿和溶液：
(1)带有转子的培养皿（6cm)包扎灭菌；
(2)菌需取照射前稀释至10-8，照射1min取稀释至10-8，照射2min取稀释至10-7，照射3min
取稀释至10-6，因此需准备稀释管（4.5ml）共：8+8+7+6=29支试管。

(3)稀释液为生理盐水：0.85％氯化钠溶液，共需量为：29×4.5=130.5ml，因此，最少配制
150ml。

(4)培养基：淀粉培养基（书p277），准备的量：4个时间，每个时间取3个稀释度，每个稀
释度1个平行，共需准备12个平皿，每个平皿中加入15ml培养基，因此至少需配制培养基180ml，每组按200ml进行配制，按书上配方进行称量并调pH。

移液管包扎：稀释用（至少4支）、加平板用（至少4支）
二、实验原理——抗菌素滤纸片法测定生物效价
将某些蘸有抗菌素的滤纸片贴到已涂布检定菌的培养基表面上，抗菌素将抑制周围微生物的生长，抑制的效果与抗菌素的效价成正比，因此，当检定菌生长成菌苔后，即可观察到抑制菌体生长的情况。

操作方法：
1、检测用平板的制备
将琼脂培养基灭菌融化，倒平板凝固后，用无菌吸管吸取1ml培养好的试验菌液0.2ml，采用涂布法均匀涂于平皿表面。

2、青霉素的抑菌效价测定
将直径5mm的圆形滤纸片，分别蘸取1、10、100 u/ml的青霉素溶液。

在管壁贴至无液体流出时，放置在上述培养的表面上，轻压固定，然后将培养皿放入37℃的培养箱中，培养16-18小时，测定抑菌圈的直径。

注：以上操作均在无菌条件下进行。

需准备器皿与溶液：
（1）稀释管：青霉素10万单位/克，按10倍稀释法称取0.01克于100ml生理盐水中，为1000U/ml，再用3个稀释管即可。

（2）稀释液为生理盐水：共需量为：100+3×4.5=112.5ml。

（3）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（书p275），准备的量：取3个稀释度，每个稀释度1个平行，共需准备3个平皿，每个平皿中加入15ml培养基，因此至少需配制培养基45ml，每组按100ml进行配制，按书上配方进行称量并调pH。

（4）移液管包扎：稀释用（至少1支）、加平板用（至少1支）
（5）无菌滤纸片：用打孔器打出直径5mm的滤纸片，至少准备12片。

用纸包扎后灭菌。

实验——噬菌体效价的测定
一、目的要求：
1.学会噬菌体的检查及其效价测定方法
2.学会观察识别噬菌斑
二、基本原理：
噬菌体是专性寄生微生物细胞的病毒。

按其感染细菌的过程，可分成烈性噬菌体和温和噬菌体。

烈性噬菌体侵染细菌后迅速引起敏感菌裂解，温和噬菌体侵染细菌后一般不引起细菌裂解，使宿主成为溶源性细菌，在双层琼脂平板上出现透明噬菌斑中心的菌落。

噬菌体的效价就是1 mL培养液中所含活噬菌体的数量。

效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。

由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体长生肉眼可见的噬菌斑。

因此，能进行噬菌体的计数。

但因噬菌斑计数方法其实效率难以接近100%（一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达病毒菌悬液的浓度（效价）一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位（plague-forming units，简写成pfu）。

测定过程：
1）.取0.5ml噬菌体浓缩液，加到4.5ml/管的1％蛋白胨水进行10倍系列稀释，依次稀释至10-9稀释度。

2）.分别吸取最后三个稀释度的噬菌体稀释液0.1ml，加入到已含有0.2ml敏感菌菌液的试管中。

3）.每制备底层平板：平皿中先倒入肉膏蛋白胨固体培养基。

4）.将含有敏感菌和噬菌体混合液的试管与45-50℃保温的5ml上层半固体培养基混合均匀，倒入底层平板上，使上层培养基均匀地铺满整个底层平板。

噬菌体的效价
双层法：(每组做3个稀释度，每个稀释度做2皿；另加对照1皿，共7皿)
注意事项：
噬菌体对温度极其敏感，一般噬菌体60℃下5分钟绝大部分失活.因此加入上层培养基的温度要严格保持50℃以下，为防止琼脂凝固，此步操作要快，均匀铺满，不能出气泡。

为保证获得单一，彼此分离的噬菌斑，培养皿盖上和培养基表面不得有凝结水滴。

正置培养，不能倒置。

每皿噬菌体数量不能太多，维持100-300个为宜，否则噬菌斑不能分开而连成一片。

同组同学分工合作协调好，一位稀释噬菌体同时移噬菌体液以及移指示菌液；一位倒制底层平板同时拿上层试管接好移液。

准备器皿与溶液：
（１）1％蛋白胨水：P278（8）调pH。

准备量：4.5ml×9管=40.5ml。

至少准备50ml，并分装在9个试管中，包扎并灭菌。

（２）噬菌体增殖培养基：P276（二）调pH。

半固定培养基11管，每管5ml，至少55ml，按100ml配制。

固体培养基共11个平皿，每皿15ml，至少准备165ml，按200ml准备。

（３）移液管：稀释噬菌体并加入试管2支，吸敏感菌1支，至少3支。

本次实验准备器皿与溶液：
(1)配制生理盐水250ml，准备100ml装入三角瓶中，包扎并灭菌；准备4.5ml生理盐水管共
32支，包扎并灭菌。

(2)1％蛋白胨水：P278（8）调pH。

50ml，并分装在9个试管中，包扎并灭菌。

(3)移液管包扎：12支
(4)淀粉培养基（书p277），准备的量：每组按200ml进行配制，按书上配方进行称量并调
pH后，直接将2%琼脂加入到三角瓶中，不需融化，即可包扎灭菌。

(5)牛肉膏蛋白胨培养基（书p275），每组按400ml进行配制，按书上配方进行称量并调pH，
分装至250ml三角瓶，每瓶150ml，各加3克琼脂（2%）；剩余100ml加入0.8克琼脂（0.8%）于1个三角瓶中，不需融化琼脂，即可包扎灭菌。

(6)带有转子的培养皿（6cm)包扎灭菌；
(7)无菌滤纸片：用打孔器打出直径5mm的滤纸片，至少准备12片。

用纸包扎后灭菌。

实验报告内容：
１．记录每组配制准备的器皿与溶液的量并分析其计算过程。

２．斜面菌种保藏方法及记录你所获得的菌种斜面特征。

五、实验报告
1、记录双层平板上的噬菌斑数目，计算噬菌体效价：
（注:噬菌体校价=pfu数×稀释倍数×10）
2、思考题：
（１）测定噬菌体的效价，操作时要注意些什么才能测定准确？
（２）计算噬菌体效价时，选择30-300个pfu的平板计数较好，为什么？（３）如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？。