恩诺沙星残留检测方法标准(试行)牛可食性组织中恩诺沙星残留量检测液相色谱-串联质谱法(试行)2020版
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽肉中27种磺胺及喹诺酮类药物的残留
华 孝成 杨 飞 萍 邵 歆 虞 贺 新 金 叶 舟
（ 温 州市农 产 品检 验、 ？ 贝 ４ 试 中心 ，温 州 ３ ２ ５ ０ １ ４ ）
摘 要 ：本 文建 立 了 超 高 效 液 相 色 谱 一 串联 质 谱 仪 同时 分 析 畜 禽 肉 中磺 胺 及 喹 诺 酮 类 共 ２ ７种 抗 菌 素 残 留 的 检 测 方 法
用 乙腈 提 取 样 品 中待 测 组 分 ，经 旋 转 蒸 发 浓缩 至 干 ，用 ｌ ｍ Ｌ１ ０ ％ 乙腈 一 ０ ． １ ％ 甲酸 水 溶 解 ，正 己烷 冷冻 离 心脱 脂 ．应 用Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ— ＭＳ ／ Ｍ Ｓ采 用 梯 度 洗 脱 进 行 色 谱 分 离及 多 反 应 监 测 质 谱 分 析 模 式 １ ０ ａｉ ｒ ｎ内 同 时 对 畜 禽 肉 中 ２ ７种 磺 胺 及 喹 诺 酮 用 外 标 法 进 行 定 性 和 定 量 测 定 。 分 别 对 鸡 肉 空 白基 质 进 行 ３个 水 平 （ ２ ． ０￣ ｇ ／ ｋ ｇ ，１ ０ ． ０￣ ｇ ／ ｋ ｇ ，２ ０ ． ０￣ ｇ ／ ｋ ｇ ） 的加 标 回收 试 验 ，其 回 收 率 为 ７ ０ ． Ｏ ％～１ ２ ２ ． ７ ％。３ 个 浓 度 的 添 加 回收 方 法 的相 对 标 准 偏 差 低 于 １ ７ ％ 。２ ７种 待 测组 分 以 最 低 统 计 检 出 限均 为 ０ ． ２ ｇ ／ ｋ ｇ ，定 量 限为 ０ ． ５￣ ｇ ／ ｋ ｇ 。该 方 法 样 品前 处 理 简 单 、快 速 、准 确 性 、重 复 性 好 。可 用 于 畜 禽 肉 中 ｌ ６种 磺 胺 及 ｌ １ 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 日常 分 析测 定 关 键 词 ：超 高效 液 相 串联 质 谱 ；冷 冻 除 脂 ；磺 胺 ；喹 诺 酮 ；残 留
牛羊组织中β-受体激动剂残留检测 超高效液相色谱-串联质谱法
DB 21/3004—2013
3.2.15 标准储备液（100 μg/mL）：准确称取适量的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯 丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗对照品，用甲醇分别配制成 100 μg/mL 的标准 储备液，2~8 ℃冰箱中保存，有效期为 3 个月。 3.2.16 混合标准中间液（1 μg/mL）：分别准确吸取 1.0 mL 的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非 诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗标准储备液至 100 mL 容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度，2~8 ℃冰箱中保存，有效期为 1 个月。 3.2.17 同位素内标储备液（100 μg/mL）：分别取三种同位素内标，各自用甲醇配成浓度约为 100 μg/mL 的储备液，2~8 ℃冰箱中保存，有效期为 3 个月。 3.2.18 混合同位素内标工作液（100 μg/L）：将上述三种同位素内标储备液，用 0.2%甲酸水溶液稀 释成约 100 μg/L 的混合工作液，2~8 ℃冰箱中保存，有效期为 1 个月。 3.2.19 混合标准及内标工作液（10 μg/L）：准确吸取 1.0 mL 的混合标准中间液（3.2.16）和 10.0 mL 混合同位素内标工作液（3.2.18）至 100 mL 容量瓶中，用 0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，2~8 ℃冰箱中 保存，有效期为 1 周。 3.3 仪器和设备 3.3.1 超高效液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）。 3.3.2 涡旋混合器。 3.3.3 冷冻离心机。 3.3.4 恒温定时振荡器。 3.3.5 旋转蒸发仪。 3.3.6 固相萃取装置。 3.3.7 MCX 固相萃取柱(CNW ，for β-agonists)：60 mg/3 mL。 3.3.8 氮吹仪。 3.4 测定步骤 3.4.1 样品处理
恩诺沙星质量标准+恩诺沙星检验操作规程
恩诺沙星质量标准文件类别 SMP起 草： 年 月 日 审 核： 年 月 日 批 准： 年 月 日 执行日期： 年 月 日文件名称 恩诺沙星质量标准 文件编码SMP-QMP20202目的：制定恩诺沙星的质量标准。
适用范围：恩诺沙星的检验责任人：化验员、化验室主任、质量部长。
标准依据：《中国兽药典》2010年版一部 内容：本品为1－环丙基－6-氟－4－氧代－1，4－二氢－7－（4－乙基－1－哌嗪基）－3－喹啉羧酸。
按干燥品计算，含C 19H 22FN 3O 3不得少于99.0%。
【性状】 本品为微黄色或淡橙黄色结晶性粉末；无臭，味微苦；遇光色渐变为橙红色。
本品在氯仿中易溶，在二甲基甲酰胺中略溶，在水中极微溶解；在氢氧化钠试液中易溶。
熔点 本品的熔点 为221～226℃。
熔融时同时分解。
【鉴别】(1)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
（2）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。
【检查】氟喹啉酸 取本品，加0.1mol/L 氢氧化钠溶液溶解并制成每1ml 中约含10mg 的溶液，作为供试品溶液；另取氟喹啉酸对照品约 5.0mg ，精密称定，置50ml 量瓶中，加6mol/L氨溶液0.05ml 与水适量使溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，用水稀释成每1ml 含20µg 的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色普法 试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶GF 254薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-冰醋酸-水（50：9：25：15）为展开剂，直立展开，晾干约15分钟，置紫外光灯（254nm ）下检视 。
供试品溶液如显与对照品溶液相同的杂质斑点，其颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深（0.2%）。
有关物质 取本品适量，加流动相制成每1ml 含0.25mg 的溶液，作为供试品溶液；另取恩诺沙星、盐酸环丙沙星对照品适量，用流动相制成每1ml 各含0.25mg 的溶液，作为系统适用性试验溶液。
DB22T 1997-2014 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定液相色谱-串联质谱法.pdf
4.16 Oasis HLB 固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 4.17 滤膜：0.22 μm。 4.18 氮气。
5 仪器
不得翻印
本 5.1 液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾电离源。 标 5.2 涡旋振荡器。 准 5.3 固相萃取装置。 仅供 5.4 分析天平：感量 0.1 mg。 内 5.5 粉碎机。 部 5.6 旋转蒸发仪。 使用 5.7 氮气吹干仪。
仅 水甲醇溶液洗脱，供液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。 供内 4 试剂与材料
部使 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；除另有说明外，水为GB/T 6682规定的一级水。 用 4.1 甲醇，色谱纯。
4.2 乙腈，色谱纯。 4.3 磷酸。 4.4 甲酸，色谱纯。 4.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）。
5.8 离心机。 6 试样制备
选取代表性饲料样品至少500 g，按照GB/T 20195制备试样。
不得翻印
7 分析步骤
7.1 提取
称取试样0.5 g(精确至0.1 mg)于50 mL具塞离心管中，准确加入6 mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，涡旋混 匀，再加入10 mL乙腈(4.2)，于涡旋振荡器振荡提取1 min，5000 r/min离心5 min，上清液过滤到鸡心 瓶中，在残渣中加入5 mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，10 mL乙腈(4.2)，重复以上步骤，合并上清液，于50 ℃ 旋转蒸发，至乙腈全部蒸出。加入5 mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，混匀。
本标准仅供内部使用 图A.4 恩诺沙星的 MRM 色谱图 不得翻印 _________________________________
6
准仅供内部使用 method 不得翻印
2014 - 02 - 28 发布
2019年农业农村部畜禽产品兽药残留限量和检测方法
羟基地美硝唑Dimetridazole-OH 0.5
地克珠利Diclazuril
鸡/肉Chicken/Muscle
高效液相色谱法HPLC（GB 29701-2013）
地克珠利Diclazuril 50
500
氟苯尼考及其代谢物Florfenicol and its Metabolites
氟喹诺酮类Fluoroquinolones
鸡/蛋Chichen/Egg
液相色谱质谱法LC-MS-MS（GB/T 21312-2007)高效液相色谱法HPLC（781号公告-6-2006）
环丙沙星Ciprofloxacin 10
不得检出ND
恩诺沙星Enrofloxacin 10
洛美沙星Lomefloxacin 0.5
恩诺沙星Enrofloxacin：25
100
环丙沙星Ciprofloxacin：25
达氟沙星Danofloxacin：7.5
30
氟甲喹Flumequine：12.5
50
洛美沙星Lomefloxacin 0.5
不得检出ND
氧氟沙星Ofloxacin 0.5
诺氟沙星Norfloxacin 1.0
培氟沙星Pefloxacin 1.0
高效液相色谱法HPLC（GB 29696-2013）
阿维菌素Abamectin：1
不得检出
ND
多拉菌素Doramectin：1
伊维菌素Ivermectin：1
10
氟喹诺酮类Fluoroquinolones
牛/奶Cow/Milk
液相色谱质谱法LC-MS-MS（GB/T 21312-2007)高效液相色谱法HPLC（GB 29692-2013）
高效液相色谱法检测水产品中三种喹诺酮类药物残留量方法研究
高效液相色谱法检测水产品中三种喹诺酮类药物残留量方法研究作者：暂无来源：《渔业致富指南》 2018年第16期本试验改进了农业部783号公告-2-2006水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留量的高效液相色谱法，并对样品的提取条件和色谱方法进行了优化分析，确定使用盐酸酸化乙腈提取，固相萃取小柱净化，高效液相色谱-荧光检测器检测、外标法定量的分析方法。
本方法漂移率小，对三种喹诺酮类药物标准曲线回归系数在0.999以上，线性范围1~1000μg/L，定量限1μg/kg。
对草鱼、对虾样品进行三种喹诺酮类药物加标回收率的验证实验，回收率在79.2%~105.0%之间，相对标准偏差在0.83%~9.85%之间，批次间标准偏差在 5.00%~10.57%之间，说明方法前处理提取效率和准确度满足分析要求。
1.材料与方法1.1.仪器、试剂、标准品与耗材试验材料来自历次农业部例行采集样品，品种有草鱼和对虾。
岛津LC-20AD高效液相色谱仪（配荧光检测器RF-20A），LC Solution工作站与Waterse2695高效液相色谱仪（配荧光检测器2475），Empower 3工作站；色谱柱为Thermo AcclaimC18与安捷伦ZORBAX SB-C18，规格均为4.6m m×250mm，I.D.5μm。
三种沙星标准品均为Dr.Ehrenstorfer。
其中诺氟沙星纯度为99.1%，环丙沙星纯度为95.0%，恩诺沙星纯度为99.0%。
分别称取诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准品各0.01g（精确至0.0001g），用色谱纯级甲醇溶解，必要的时候使用超声助融，定容到100mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存，有效期6个月。
试验使用试剂及其他仪器规格如下（表1-表3）：1.2.实验前处理的优化1.2.1.样品的处理方法取鱼、虾肌肉，切成小块，匀浆机打成匀浆后准确称取5.00g（±0.05g）样品，置于50mL 离心管中，加入15mL提取剂，盖紧盖子，置于振荡器上振荡5min，4500r/min离心5min，上清液倒入另外一支50mL离心管中。
牛可食性组织及牛奶中氮氨菲啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法(食品安全标准)
牛可食性组织中氮氨菲啶残留量的测定液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了牛肌肉、脂肪、肝脏、肾脏及牛奶中氮氨菲啶残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于牛肌肉、脂肪、肝脏和肾脏及牛奶中氮氨菲啶残留量的检测。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理试料中残留的氮氨菲啶，用乙腈、甲酸铵-甲醇溶液提取，正己烷脱脂，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。
4试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1试剂4.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
4.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
4.1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
4.1.4 正己烷（C6H14）。
4.1.5 无水硫酸钠（Na2SO4）。
4.1.6 甲酸铵（HCOONH4）。
4.2溶液配制4.2.1 0.25mol/L甲酸铵-甲醇溶液：取甲酸铵15.8g，用甲醇溶解并稀释至1000mL。
4.2.2 0.1%甲酸溶液：取甲酸1.0 mL，用水溶解并稀释至1000 mL。
4.2.3 80%甲醇溶液：取甲醇400mL，用水溶解并稀释至500mL。
4.2.4 提取液：取乙腈和0.25mol/L甲酸铵-甲醇溶液按1：1（体积比）混匀。
4.3 标准品盐酸氮氨菲啶（Isometamidium Chloride,C28H26ClN7,CAS号:34301-55-8），含量≥95.0%。
4.4 标准溶液的制备4.4.1 标准贮备液：取氮氨菲啶标准品10mg，精密称定，于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准贮备液。
-20℃以下保存。
4.4.2 10 µg/mL氮氨菲啶标准工作液：精密量取标准贮备液100 µL，于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10 µg/mL的氮氨菲啶标准工作液。
高效液相色谱—串联质谱法测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氢弹沙星
高效液相色谱—串联质谱法测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氢弹沙星作者：王洋等来源：《吉林蔬菜》2015年第01期摘要：建立饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。
试样用磷酸盐缓冲溶液提取，经固相萃取小柱净化，氮气吹干后用溶解待测。
采用LC-MS/MS测定，色谱柱为C8反相色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，电喷雾正离子模式电离，多反应选择离子检测（MRM），外标法定量。
结果表明方法可用于饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的同时测定。
关键词：饲料；液相色谱-串联质谱；恩诺沙星；环丙沙星；诺氟沙星；多反应监测【中图分类号】TS214.2 【文献标识码】AAbstract：To establish a liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for determinations of enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin in Feeds.enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin were extracted by sonication with Phosphat buffer solution.By the SPE cartridge and nitrogen dry，the extracts were dissolved.The separations were performed on a C8 reversephase columnusing acetonitrile-0.1%formic acid as the mobile phase.The analysis was carried out under positive ESI MS/MS and multiple reaction monitoring mode （MRM）.The method was proved to be simpl and accurate.Key words：Feeds；Liquid chromatography-mass spectrometry；Enrofloxacin，Ciprofloxacin；Norfloxacin；Multiple reaction monitoring恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星属于喹诺酮类药物，由于其具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌浓度低等优点，被广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗。
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恩诺沙星残留检测方法标准（试行）牛可食性组织中恩诺沙星残留量检测液相色谱-串联质谱法（试行）
1范围
本标准规定了牛可食性组织中恩诺沙星和环丙沙星残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于牛的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中恩诺沙星和环丙沙星残留量的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试料中残留的恩诺沙星、环丙沙星经提取液提取，离心后取上清液，以正己烷净化，弃正己烷层，下层溶液氮气流吹干后复溶，离心，上清液以液相色谱-串联质谱仪测定恩诺沙星、环丙沙星残留量，内标法定量。
4试剂和材料
以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1 对照品：恩诺沙星，含量≥95%；盐酸环丙沙星，含量≥95%；盐酸恩诺沙星-d5，含量均≥95%；盐酸环丙沙星-d8，含量≥90%。
4.2 乙腈：分析纯。
4.3 乙腈：色谱纯。
4.4 甲醇：分析纯。
4.5 甲醇：色谱纯。
4.6 甲酸：分析纯。
4.7 甲酸：色谱纯。
4.8 正己烷。
4.9 1%甲酸乙腈溶液：准确量取甲酸1mL，置100mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，充分混匀。
4.10 1%甲酸乙腈溶液-甲醇（95:5, V/V）溶液：准确量取甲醇5mL，置100mL容量瓶中，用1%甲酸乙腈溶液稀释至刻度，混匀。
4.11 0.1%甲酸溶液：准确量取甲酸（色谱纯）1.00mL，置1L容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，混匀。
4.12 0.1%甲酸溶液-乙腈（95:5, V/V）：准确量取乙腈（色谱纯）5mL，置100mL 容量瓶中，加入0.1%甲酸溶液稀释至刻度，混匀。
4.13 乙腈饱和的正己烷：取一定量的正己烷加入适量乙腈，直至充分混匀静置后有分层为止。
4.14 标准储备液：根据各对照品的含量，精密称取各对照品适量，恩诺沙星、环丙沙星配制成浓度为200µg/mL的储备液，恩诺沙星-d5、环丙沙星-d8配制成浓度为100µg/mL的储备液。
将精密称取的单个对照品分别置于10mL 棕色容量瓶中，加入甲醇（色谱纯）约5mL，涡旋、超声使溶解，再用甲醇（色谱纯）稀释并定容至10mL。
-20℃保存，有效期3个月。
使用时将标准储备液按需要用甲醇（色谱纯）逐级稀释为标准工作溶液（10µg/mL、1µg/mL或100ng/mL），现配现用。
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。