吗啉反义寡核苷酸在基因功能研究中的应用

吗啉反义寡核苷酸在基因功能研究中的应用何萌萌;薛良义【摘要】吗啉反义寡核苷酸属于第三代反义寡核苷酸,主要通过阻断mRNA的剪接过程来抑制目的基因的功能.吗啉反义寡核苷酸技术现已广泛应用于发育过程中基因功能的研究；鉴于吗啉反义寡核苷酸能与病毒特异mRNA结合,形成的双链物可有效阻断病毒RNA的转录,从而抑制病毒的复制,所以该技术已应用于医学研究,如治疗病毒感染、癌症、肌营养不良症和早老综合症等疾病.主要阐述了吗啉反义寡核苷酸的结构特点、作用机制、与其它反义技术的比较,以及该技术的应用与展望.%Phosphorodiamidate morpholino oligomers are belong to the third generation of antisense oligonucleotides, and can inhibit the function of the target gene mainly by blocking mRNA splicing. Morpholino antisense oligonucleotide technology was widely used in the research of gene function during developmental process. The phosphorodiamidate morpholino oligomers and the specific viral mRNA can form the double-stranded material, which effectively block the transcription of viral RNA, and therefore inhibit the viral replication. So this technology is also used in the medical research such as treating viral infections, cancer, muscle nutrition dysplasia syndrome and Alzheimer disease. This article focused on the structure and functional mechanism of phosphorodiamidate morpholino oligomers, comparison with other antisense technologies, the applications and prospects of the technology.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P77-79,83)【关键词】吗啉反义寡核苷酸;基因功能;应用【作者】何萌萌;薛良义【作者单位】宁波大学海洋学院,宁波315211;宁波大学海洋学院,宁波315211【正文语种】中文【中图分类】Q524吗啉反义寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligomers，即PMO)因其核苷酸骨架上的吗啉环而得名，吗啉环取代了RNA中的核糖核苷酸环或者DNA中的脱氧核糖核苷酸环［1］。

吗啉反义寡核苷酸是一种新型反义寡核苷酸，能抑制细胞内mRNA的剪接过程，从而抑制基因的表达;同时具有良好的稳定性、溶解度和细胞渗透性［2］。

基于吗啉反义寡核苷酸的诸多特点，它在基因功能研究上的应用日益受到重视。

本文综述了吗啉反义寡核苷酸的结构特点，作用机制，及该反义技术在发育生物学和医学领域的应用，并对应用前景进行展望，为吗啉反义寡核苷酸技术在基因功能研究上的应用提供参考。

1 吗啉反义寡核苷酸1.1 吗啉反义寡核苷酸的结构特点在结构上，吗啉反义寡核苷酸与DNA相似，都具有标准的适用于沃森-克里克碱基配对的A、T、G、C寡核苷酸碱基，因此它可以以碱基配对的方式同RNA和DNA单链结合。

不同的是前者的这些碱基连接在吗啉环上，而DNA的碱基则连接在脱氧核糖环上。

此外，吗啉反义寡核苷酸分子结构中不带电的磷酰二胺亚基取代了核酸中的阴离子磷酸二酯。

这种独特的结构使得吗啉寡核苷酸具有以下几个特点:1)由于结构的改变，使得整个分子不再带有任何电荷，无法被核酸酶所识别，包括DNA酶和RNA酶，就能更好地抵抗核酸酶的作用，使得这类物质在细胞内有着极强的稳定性;2)吗啉反义寡核苷酸与靶序列结合后通过空间位阻效应发挥作用，不激活 RNaseH，不引起目标基因mRNA的降解;3)针对翻译起始位点区设计的吗啉核苷酸用于抑制蛋白质的翻译，针对前体mRNA剪切位点区设计的吗啉反义寡核苷酸可影响mRN剪切，得到不同的转录本，可以方便地用于目标基因结构域的突变研究;4)与靶序列结合能力强，可以渗入mRNA的二级结构，并且特异性好［3-6］。

1.2 吗啉反义寡核苷酸的作用机制吗啉反义寡核苷酸的作用机制是:当吗啉反义寡核苷酸特异性地结合到它所选择的目标位点时，能阻碍其它细胞成分与目标位点的结合，从而阻断了mRNA的剪切，进而影响蛋白质的翻译［7］。

以含两个内含子的前体mRNA为例，未剪接的前体 mRNA上(图1A)有1、2、3和4四个潜在目标位点(图1B)，当吗啉反义寡核苷酸特异性地结合到1号(图1C)和4号(图1F)目标位点时，能分别导致内含子1和内含子2不能被剪接;当吗啉反义寡核苷酸特异性结合到2号(图1D)和3号(图1E)目标位点时，均导致了外显子2的缺失。

图1 吗啉反义寡核苷酸抑制前体mRNA剪切示意图［4］Fig 1 Chart of osphorodiamidate morpholino oligomers inhibition to mRNA splicing1.3 吗啉反义寡核苷酸技术与其他反义技术的比较在当前的学术研究和临床实验中，反义寡核苷酸已经成为研究基因表达的一种重要工具。

最先出现的第一代反义寡核苷酸即硫代寡核苷酸是在利用硫原子取代磷酸骨架上的非成键氧原子的基础上形成的一类寡核苷酸类似物，它克服了寡核苷酸在血清中易被核酸酶降解的缺点而被广泛利用。

性能更优的第二代反义寡核苷酸则以硫代寡核苷酸为基础，又设计加入了嵌合性的寡核苷酸故称之为混合骨架寡核苷酸。

而第三代反义寡核苷酸——多肽核酸，由于其独特的理化性质、杂交特性以及对基因转录和翻译的调控作用，在分子生物学研究、肿瘤和传染性疾病基因治疗等方面均显示出较为广阔的应用前景［8］。

目前，运用广泛的反义技术主要有RNA干扰技术、核酶和DNA酶技术［9］。

RNA干扰是将双链RNA导入细胞引起特异mRNA降解的一种细胞反应过程，它通过对靶基因染色质结构的改变，使其基因转录受限，最终导致表达系统的关闭［10］。

核酶和DNA酶技术的作用原理是通过核酶或DNA酶与被选择的mRNA片段特异性结合来阻断mRNA的表达。

与以上两种反义技术相比较，吗啉反义寡核苷酸技术具备诸多优点，例如，吗啉反义寡核苷酸不会被核酸酶所降解，水溶性好，在细胞内稳定性极强，对细胞无毒副作用，并且不会和人工合成的RNA一样，会激活细胞干扰素的分泌，激起免疫应答［11-12］。

但是吗啉反义寡核苷酸技术也存在着一些不足之处，它最大的缺陷在于特殊的分子结构导致其不带有任何电荷，使得吗啉反义寡核苷酸无法被细胞表面的任何受体所识别，同时无法通过转染的方式导入到细胞内［13］。

因此要将吗啉反义寡核苷酸分子导入细胞，只有通过物理损伤细胞膜的方式来实现，这个缺陷极大限制了吗啉反义寡核苷酸作为一种具有潜在价值的基因特异性药物或是作为基因功能研究的工具被广泛利用。

值得庆幸的是，为配合吗啉反义寡核苷酸的使用，Gene Tools 公司开发了一套特定的输送系统，可以安全、高效地将吗啉反义寡核苷酸输送至胞浆内，因此，吗啉反义寡核苷酸也可以用于遗传学研究和新药靶标的发现以及验证［14］。

此外，吗啉反义寡核苷酸可以标上荧光基团、亲和标签以及活性反应基团，以供不同的研究需要［15-18］。

2 吗啉反义寡核苷酸技术的应用目前，吗啉反义寡核苷酸技术已经广泛应用于发育生物学和医学领域中基因功能的研究，并取得了理想的实验效果。

2.1 在发育生物学领域中的应用在发育生物学领域，吗啉反义寡核苷酸技术于2000年初被首先使用，随后在多种模式生物中得到应用，包括海胆(Howard，2001)，海鞘(Satou，2001)，非洲爪蟾(Audic，2001;Schweickert，2001;Sumanas，2001)，热带爪蟾 (Nutt，2001)，斑马鱼 (Nasevicius，Ekker，2000;Bauer，2001;Ross，2001;Segawa，2001;Shepherd，2001;Yang，2001)，鸡(Kos，2001)和小鼠(Coonrod，2001)等［18］。

例如，利用显微注射法将能特异性抑制raldh2基因的吗啉反义寡核苷酸(raldh2-MO)注入到小鼠体内阻断视黄酸合成，并通过构建raldh2-EGFP重组质粒来动态观察胚胎心脏发育、心率及心室收缩的变化。

结果显示raldh2-MO的注射有效且特异性地抑制了视黄酸的合成，视黄素的缺乏最终导致了小鼠胚胎心脏发育异常，出现心包腔水肿，部分心脏呈线性管状，心房心室发育异常，房室管血流返流，血流缓慢，心脏搏动节律规则但心室率下降［20］。

张宇声等人通过显微注射法将吗啉反义寡核苷酸导入斑马鱼的受精卵，并通过荧光显微镜观察斑马鱼胚胎循环系统的发育情况。

结果发现吗啉反义寡核苷酸在斑马鱼胚胎中抑制了与人类FHL2同源的基因zgc:92428基因的mRNA转录，最终导致斑马鱼胚胎发育的异常，伴有斑马鱼胚胎脉管系统的发育阻滞，并增加了胚胎的死亡率。

徐进等人在研究smych1基因在斑马鱼胚胎慢肌形成过程中的作用时，发现了一种新的剪接方式，将能特异性抑制smych1基因的吗啉反义寡核苷酸(smych1-MO)注入斑马鱼胚胎，与之相邻的一段内含子序列未被剪接［21］。

2.2 在医学领域中的应用在医学领域中，鉴于吗啉反义寡核苷酸与病毒特异mRNA结合形成的双链物可有效阻断病毒RNA转录，从而抑制病毒的复制，所以该技术也被广泛应用于临床治疗，其中在治疗病毒感染、癌症、肌营养不良症和早老综合症等疾病中的应用最为普遍。

研究发现，核纤层蛋白A基因的突变与早老综合症有关，在大多数的早老综合症病例中，外显子Ⅱ处隐蔽剪接位点被激活，导致此外显子3'端-150位核苷酸异常，形成150个基因突变的mRNA，最终产生了缺失50个氨基酸的核纤层蛋白A［22］。