反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转效应
膀胱癌的药物耐药机制与逆转
论文题目：膀胱癌的药物耐药机制与逆转1. 引言膀胱癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，药物治疗在其管理中起着重要作用。
然而，药物耐药性的出现严重限制了治疗效果，因此研究膀胱癌药物耐药的机制及逆转策略具有重要意义。
2. 药物耐药机制2.1 多药耐药蛋白（MDR）●MDR 是细胞膜上的跨膜蛋白，可以通过主动运输药物从而降低细胞内药物浓度，使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。
2.2 肿瘤干细胞●肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，对化疗药物具有较高的耐药性，是膀胱癌药物耐药的重要机制之一。
2.3 肿瘤微环境●肿瘤微环境中的细胞因子、生长因子等因素可以促进药物耐药的发生，如炎性反应和肿瘤相关纤维化等。
2.4 基因突变●一些基因的突变或过度表达可以影响细胞对化疗药物的敏感性，如 P53、MDR1 等基因。
3. 药物耐药的逆转策略3.1 靶向耐药机制●了解药物耐药机制后，可以通过针对性的靶向治疗来逆转耐药性，如使用 MDR 抑制剂、靶向肿瘤干细胞等。
3.2 联合治疗●联合使用多种药物可以通过不同途径作用于肿瘤细胞，减少单一耐药性的发生。
3.3 免疫治疗●免疫治疗可以激活患者自身的免疫系统，提高对肿瘤的识别和清除能力，对药物耐药具有一定的逆转作用。
3.4 肿瘤微环境调节●调节肿瘤微环境中的细胞因子、生长因子等因素，可以影响药物耐药性的发生，如使用炎症因子拮抗剂等。
4. 临床研究和展望●未来的研究将更加注重药物耐药机制的深入理解和逆转策略的研发，为提高膀胱癌治疗效果和预后带来新的希望。
5. 结论药物耐药性是膀胱癌治疗中面临的重要挑战，其机制复杂多样，包括多药耐药蛋白、肿瘤干细胞、肿瘤微环境等因素。
通过深入研究耐药机制并采取逆转策略，可以提高膀胱癌的治疗效果和预后。
PgP介导的多药耐药的逆转的研究进展
ＰｇＰ介导的多药耐药的逆转的研究进展
张正平１，孙勇２，张正慧３，孙启峰２ （１．山东省莱芜市高庄医院，山东莱芜２７１１００； ２．山东省莱芜市人民医院，山东莱芜２７１ １００；３．山东省莱芜市牛泉医院，山东莱芜２７１ １００）
［中图分类号］Ｒ７３０．５３ 文章编码：１００１—８１３Ｉ（２０１０）Ｏｌ一００５４—０２
ＴＭＱ８００巾，转染核酶后ＭＯＬＴ３／ＴＭＱ８００对ＶＣＲ的耐药性 由原来的７００倍（与其母细胞ＭＯＬＴ３比较）下降至２０—３０
倍。在耐药的胰腺癌细胞系应用核酶逆转ＭＤＲ，耐药性更
是由原来的１６００倍Ｆ降至５．３倍。
目前通过细胞内注射法、电穿孑Ｌ法、氯化钙、脂质体介导
法进行外源性导入，但在导入细胞过程中极易被核酶降解。 用化学方法对核酶加以修饰，可以提高其抵抗核酸酶的能
增加，推测抑制Ｐ ＫＣ的活性可以对抗ＭＤＲ的发生。 ＣＧＰ４１２５１是高度选择性的Ｐ ＫＣ抑制剂，具有抗肿瘤作用及 有效的耐药逆转作用，它可使３种ＭＤＲ细胞系对阿霉素和
长春新碱的敏感性增加。Ｐｇｐ是一个ＡＴＰ依赖的“药泵”， ＣＧＰ４１２５１可能是直接与Ｐｇｐ竞争ＡＴＰ或通过竞争Ｐｇｐ上的 药物结合位点，从而阻断了ＰｇＰ的泵出功能，达到逆转耐药 的作用．目前，对ＣＧＰ４１２５１逆转机制尚不清楚，需进一步研 究。ＫＴ一５７２０是另一具有逆转ＭＤＲ的蛋白激酶抑制剂，在 非毒性的浓度下可有效增加耐药细胞ＫＢ—Ｖ１、ＨＵ一１对化 疗药物的敏感性，其抗耐药机制尚不清楚。
杂志，２００４，２（２）：１２０—１２１．
［２］Ｂｅｒｇｍａｎ ＡＭ，Ｐｉｎｅｄｏ ＨＭ，’Ｆａｌｉａｎｉｄｉｓ １，ｅｔ ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｏｆ Ｐ—－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ—·ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ—·ａｓ－
抗肿瘤药物的耐药机制与逆转策略
抗肿瘤药物的耐药机制与逆转策略随着科技的进步和医疗技术的不断发展，肿瘤治疗取得了重大的突破。
然而，肿瘤耐药性问题一直困扰着临床医生和患者。
耐药性是指肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生的抗性，导致药物失去效果。
本文将重点探讨抗肿瘤药物的耐药机制以及逆转耐药性的策略。
一、耐药机制1. 基因突变基因突变是导致肿瘤细胞产生耐药性的重要机制之一。
肿瘤细胞会发生突变，使得药物靶点的结构发生改变，从而失去与抗肿瘤药物结合的能力。
例如，肿瘤细胞突变后的蛋白质结构会阻碍药物结合，使药物无法发挥作用。
2. 表观遗传学变化表观遗传学变化是指对基因表达的调控，而不改变基因本身的序列。
这种变化在肿瘤细胞耐药性中起着重要作用。
例如，DNA甲基化和组蛋白修饰等改变会导致基因的失活或过度表达，从而减少药物对肿瘤细胞的效果。
3. 肿瘤微环境肿瘤微环境对肿瘤细胞的增殖和侵袭具有重要的调节作用。
在肿瘤微环境中，存在一些细胞因子和信号分子，它们能够通过多种途径促进肿瘤细胞的生长和存活。
同时，肿瘤微环境中的细胞间相互作用也会对抗肿瘤药物的疗效产生影响。
二、逆转策略1. 组合治疗组合治疗是目前临床应用最广泛的逆转耐药性策略之一。
通过同时或交替使用多种抗肿瘤药物，可以避免单一药物导致的耐药性。
组合治疗可以通过不同的靶点以及不同的作用机制，综合发挥抗肿瘤的效果，降低耐药性的风险。
2. 靶向治疗靶向治疗是根据肿瘤细胞的特异性靶标，选择相应的抗肿瘤药物进行治疗。
与传统的化疗药物相比，靶向药物可以更精确地作用于肿瘤细胞，减少对正常细胞的毒副作用。
同时，靶向药物也可以通过作用于特定的信号通路，逆转肿瘤细胞的耐药性。
3. 免疫治疗免疫治疗是利用激活患者自身免疫系统来攻击和杀灭肿瘤细胞的治疗策略。
通过调节免疫系统的功能和增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和攻击能力，免疫治疗可以逆转肿瘤细胞的耐药性。
4. 补充治疗在抗肿瘤治疗过程中，适当的营养支持和身体护理也是逆转耐药性的重要策略。
反义核酸的研究进展
vitro1J C lin Pharm Sci,1996,5(2):8816 郑俊民主编1经皮给药新剂型1北京:人民卫生出版社,19971 78～8617 李娅芳,邓英杰,刘淑琴,等1透皮吸收制剂研究进展1中国药学杂志,1997,32(1):318 陈小平1电致孔法促进药物的透皮吸收1国外医学・药学分册, 1999,26(4):22219 P rausnitz M R,Edel m an E R,Gi m m J A,et al.T randerm al deliv2ery of heparin byeletropo rati on.B i o techno logy,1995,13(11): 120520 M ichealM,V ijeyalak shm i G,L i po som e.A selective drug delivery system fo r the top ical route of adm inistrati on:gelclo sago fo rm.J Pharm Pharm aco l,1982,34(7):47221 朱于村1促进透皮给药的物理和生化方法1国外医学・药学分册,1993,10(6):357(收稿日期:2000212226)反义核酸的研究进展赵 倩(天津医科大学药学院 天津300203) 摘 要 从反义核酸的作用机理、药理作用及化学修饰等方面介绍当前在这一领域的最新研究成果。
反义核酸作为一种生化药物,在治疗病毒感染性疾病、心血管疾病以及肿瘤、艾滋病和遗传性疾病方面,与传统药物相比更具有选择性和高效低毒。
关键词 反义核酸 作用机理 药理作用 化学修饰 中图分类号:Q52 文献标识码:A 文章编号:1006-5687(2001)02-0007-04 随着分子生物学的飞速发展以及对控制生物体性质与功能的基因及作用机制认识的提高,人类有可能在基因水平上阻断或控制某些异常基因或感染病毒的表达,从而达到控制疾病的目的。
癌症耐药性机制及逆转策略
癌症耐药性机制及逆转策略癌症是一种常见的疾病，也是一种极具破坏力的疾病，传统治疗方法包括手术、放疗、化疗等，对于患者来说都带来了不小的痛苦。
然而即使接受了全面治疗，仍然会有患者的肿瘤反复出现，而这种反复性的发作难以根除正是由于癌症耐药导致的。
癌症耐药性是指在正常治疗下，肿瘤细胞逐渐对疗法产生耐药，使得治疗无效。
本文将对癌症耐药性机制及逆转策略进行详细阐述。
一、癌症耐药性机制1、多药耐药性机制（MDR）多药耐药性（MDR）是一种常见的药物耐受现象，它使得肿瘤细胞在较短时间内对不同类别的抗肿瘤药物具有阻抗作用，使肿瘤细胞逐渐耐受各种不同的抗组织胺药、抗氟胞嘧啶药和其他相关抗癌药物。
主要机制涉及膜转运蛋白超表达、噬菌体蛋白表达和DNA损伤修复途径的变化等。
2、问药耐药性机制问药耐药性（AD) 的机制比 MD 更为复杂，包括内激酶信号途径的激活、损伤修复的增强及代谢物转移表达的改变，导致在合理剂量下仍可繁殖和形成耐用肿瘤。
3、肿瘤微环境耐药性机制肿瘤微环境耐药性是由肿瘤细胞周围的环境，包括肿瘤细胞外基质、母细胞和肿瘤周围的血管所产生的反应引起的。
这些因素支持肿瘤细胞的生长和生存，有时又使肿瘤细胞对抗药物耐药性，导致化疗失效。
以上三种机制均极大限制了化疗的效果，因此寻找能够减少耐药性的逆转策略已经成为重点研究领域。
二、逆转策略1、肿瘤细胞凋亡逆转策略肿瘤细胞的凋亡是一种正常细胞死亡的形式，它被认为是控制恶性肿瘤的重要机制之一。
近年来研究发现，肿瘤细胞耐药性的产生也与凋亡能力的改变有关。
一些研究通过调节凋亡相关蛋白，如Caspase，可抑制肿瘤细胞的生长，带来很好的治疗效果。
2、肿瘤细胞增殖逆转策略肿瘤细胞增殖、分化和细胞凋亡等过程涉及多个信号通路，抑制其增殖是目前癌症治疗的主要方式。
逆转耐药可利用药物，平衡细胞增殖危象，最终达到长时间治疗的目的。
3、肿瘤细胞代谢逆转策略癌症耐药性的机制之一是肿瘤细胞代谢变化，调节肿瘤细胞的代谢即变得非常重要。
以P_糖蛋白为靶点的肿瘤多药耐药逆转剂
文章编号: 1000-1336(2010)05-0699-05以Ｐ－糖蛋白为靶点的肿瘤多药耐药逆转剂谢 婷 冯璐璐 刘瑞媛 李发荣陕西师范大学生命科学学院，西安710062摘要：肿瘤的多药耐药性(m u lt id r u g r e s is ta n c e , MD R )是导致化疗失败的主要原因，因此寻找高效低毒的MD R 逆转剂已成为肿瘤药物开发领域的热点。
P -糖蛋白是引起多药耐药性产生的重要因素之一，也是目前肿瘤多药耐药逆转剂最重要的药物靶点。
本文介绍了P -糖蛋白的结构、功能和作用机制，以及以P -糖蛋白为靶标的肿瘤多药耐药逆转剂的开发现状。
关键词：多药耐药；P -糖蛋白；逆转剂中图分类号：收稿日期：2010-03-09陕西省自然科学基金项目(S J 08–Z T 10)资助作者简介：谢婷(1986-)，女，硕士生，E -m a i l :xieting1986@ ；冯璐璐(1984-)，女，硕士生, E-mail ：fenglulu@ ；刘瑞媛(1983-)，女，硕士生,E-mail: liuruiyuan@ ；李发荣(1972-)，男，副教授，通讯作者，E-mail: lifarong@化疗在肿瘤治疗中的地位非常重要，而化疗过程中产生的多药耐药性是肿瘤治疗的主要障碍[1]，也是多数肿瘤患者预后不佳的主要原因。
因此，寻找高效、低毒、作用靶点广泛的多药耐药逆转剂已成为肿瘤研究领域的热点。
肿瘤的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构各异、作用机制不同的抗肿瘤药物亦产生交叉耐药现象[2]。
引起肿瘤MDR 的机制很复杂，目前已知的机制有：谷胱甘肽S-转移酶的过度表达，DNA 拓扑异构酶II 表达上调或者DNA 拓扑异构酶II 基因突变，抑瘤基因p53的突变或Bcl-2基因的过表达，肺耐药相关基因及A T P 结合盒一类的膜转运蛋白如多药耐药相关蛋白、P-糖蛋白、乳腺癌耐药蛋白等的过表达等[3]。
逆转多药耐药的实验操作步骤
逆转耐药性的实验步骤: （孵育时间为48h）多柔比星也叫阿霉素
1.各种给药组(多柔比星组,多帕菲,空白制剂,多西胶束制剂)对MCF-7和MCF-7/ADR细胞株
的IC50值
2.多帕菲组，空白制剂，多西胶束制剂对MCF-7和MCF-7/ADR细胞株，细胞存活率达到
90%以上的剂量
3.联合培养：针对MCF-7和MCF-7/ADR细胞株，多帕菲组，空白制剂，多西胶束制剂加入
存活率90%以上的剂量（比如设4个浓度梯度，并固定此浓度，调节多柔比星的浓度，计算多柔比星的IC50值），孵育1h后，加入不同浓度梯度的多柔比星溶液（浓度设定范围应在其IC50值以下，必须包含IC50这一浓度，可以再加一个高一点的浓度）
注意：药物联合时，配制终浓度的阿霉素时，要从母药中只取一次，减少取药多次造成误差；每一次筛药，板子上都要设空白组、单独加药阿霉素组、单独加逆转剂药物组。
4.计算耐药倍数和逆转指数。
耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50；逆转指数=使用逆
转剂前IC50/使用逆转剂后IC50。
耐药倍数，是分析耐药细胞耐药性的。
实验中用到的是逆转倍数（对耐药细胞叫做逆转倍数=使用逆转剂前IC50/使用逆转剂后IC50）；增敏倍数（联合剂与阿霉素联合对敏感细胞的增敏倍数=使用联合剂前IC50/使用联合剂后IC50）。
比较这两个倍数，如果都大于1（我们一般看逆转倍数至少在2以上才有效，越大越好），且逆转倍数更大，说明具有逆转耐药的作用的同时还具有增敏作用。
如果两个倍数一样，说明你的药物只具有增敏作用。
如果增敏倍数为1，逆转倍数大于1（我们一般看逆转倍数至少在2以上才有效，越大越好），说明你的药物具有逆转耐药的作用。
反义寡核苷酸在恶性肿瘤治疗中的作用及机制
反义寡核苷酸在恶性肿瘤治疗中的作用及机制
彭创;汤恢焕
【期刊名称】《湘南学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2007(009)003
【摘要】反义（antisense）核酸技术的基本原理是根据Watson-Crick碱基互补配对规律和核酸杂交原理，设计出能与靶基因特定区域结合的互补寡核苷酸片段，与靶基因（DNA）或信使核糖核酸（mRN-A）的特定序列相结合，以影响靶基因的表达、抑制其功能，而其他基因的转录和表达则不受影响。
封闭单个基因表达的反义的概念由Zamecnik和Stephenson首次描述，
【总页数】4页(P74-77)
【作者】彭创;汤恢焕
【作者单位】湖南省人民医院肝胆外科,湖南,长沙,410005;中南大学湘雅医院普通外科,湖南,长沙,410008
【正文语种】中文
【中图分类】Q524
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1.CTGF反义寡核苷酸对纤维结缔组织疾病的治疗作用与机制 [J], 胡小燕;汪昌运
2.生存素反义寡核苷酸在恶性肿瘤治疗中的研究进展 [J], 郝玉琴
3.5-ALA治疗和hTERT mRNA的反义寡核苷酸联合应用对人卵巢癌细胞的杀伤作用及其机制 [J], 魏晓强;唐猛;杨绍文;张友忠
4.反义寡核苷酸药物在精准治疗中的应用进展及其作用机制 [J], 周海燕
5.反义寡核苷酸药物在精准治疗中的应用进展及其作用机制 [J], 周海燕
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反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转效应摘要：目的探讨多药耐药性逆转的新方法。
方法应用基因重组方法构建能转录出mdr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入膀胱癌耐药细胞系中，测定转染细胞对不同药物的耐药性，观察反义核酸对MDR的逆转效应。
结果耐药细胞经导入反义核酸逆转录病毒质粒后，对阿霉素(ADM)、秋显著降低（P＜0.01）；细胞膜上P-糖蛋白(P-GP)染色信号水仙素(COL)的IC50显著减弱。
结论反义核酸是逆转膀胱癌多药耐药性的有效方法。
关键词：膀胱肿瘤癌多药耐药性Reversal of multidrug resistance of bladder cancer cell line withantisenes RNAHE Bin（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third MilitaryMedical University, Chongqing 400037,China）（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China）YANG Tangjun（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third MilitaryMedical University, Chongqing 400037,China）JIN Xiyu,et al.（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third MilitaryMedical University, Chongqing 400037,China）Abstract：Objective To explore the new reversal method of multidrug resistance of bladder cancer cell line.Methods A retroviral plasmid pLXSN-AS(+) containing the mdr1 mRNA antisense gene was cloned by inserting 1383bp fragment of mdr1 cDNA into multiple cloning sites of retroviral vector pLXSN. For evaluating the reversal efficiency of antisense RNA the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) was transfected into multidrug resistant cell lines BHA-60 with liposome.ResultsAfter the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) being transduced, the BHA-60 cell line showed significant decrease of IC50 to drug (P＜0.01)and the P-GP positive signal. Conclusions Antisense is a valuable method to reverse multidrug resistance of bladder cancer cell line.Key words：Bladder neoplasms Carcinoma Multidrug resistance▲为探讨膀胱癌多药耐药性（MDR）逆转的方法，我们构建了能转录出mdr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入耐药的膀胱癌细胞系BHA-60中，观察反义核酸对MDR的逆转效应。
报告如下。
材料与方法一、材料1、BIU-87 细胞：人膀胱癌移行上皮细胞系，引自北京医科大学泌尿外科研究所。
BHA-60细胞为本实验室应用转基因方法建立的多药耐药细胞系［1］。
2、pLXSN：逆转录病毒载体，在其多克隆位点上游含启动子5’- LTR，在其多克隆位点下游含SV-40启动子和Neo基因，由美国Miller教授惠赠。
质粒pHDR5A由美国Gottesman教授［2］惠赠。
3、主要试剂：（1）脂质体（DoTap）、TriPure(tm) RNA提取试剂盒、DNA快速连接试剂盒，购自德国Boehringer Mannheim公司。
（2）G418为美国Gibercol BRL公司产品，用20mmol/L的HEPES稀释成100μg/μl，0.2μm过滤器过滤除菌，分装后保存于-20℃备用。
二、方法1、细胞培养：细胞置于37℃，含5%CO的孵箱中培养，培养液为含有10%2新生小牛血清的RPMI-1640。
2、反义核酸质粒的构建：用EcoR I酶切质粒pHDR5A，获得1 383bp长的mdr1 cDNA；逆转录病毒载体pLXSN经EcoR I酶切后经CIAP脱磷酸化，制备线性化载体，将mdr1 cDNA与线性化pLXSN载体连接，经氨苄青霉素抗性筛选，再用Hind Ⅲ酶切鉴定1 383bp mdr1 cDNA的插入方向，克隆出正向插入1 383bp mdr1 cDNA的逆转录病毒质粒pLXSN-AS （+），该质粒能在细胞内表达长1 383nt的mdr1 mRNA的反义RNA。
3、逆转录病毒质粒pLXSN-AS（+）对细胞BHA-60的转染：按说明书进行操作。
选择性培养基为含G418（终浓度为800μg/ml）的1640培养基，定期更换新鲜培养液，共选择培养14～16天，长出肉眼可见克隆，该细胞系命名为BHA-AS。
同时用pLXSN作为空载体转染对照。
）的测定采用MTT法4、细胞耐药性及细胞对ADM、COL半数抑制量（IC50［3］。
5、细胞膜上P-糖蛋白（P-GP）免疫组化染色采用ABC法［4］。
结果一、反义核酸逆转录病毒质粒pLXSN-AS(+)的构建1 383bp的mdr1 cDNA片段，与pLXSN脱磷酸化载体加入T4 DNA连接酶，连接液常规方法导入大肠杆菌JM109中，挑选经Amp筛选的3个转化子，小量扩增，提取质粒。
用HindⅢ酶切鉴定插入方向，结果见1所示。
转化子3为正向插入，在5'-LTR启动子作用下能转录出mdr1 mRNA反义RNA。
1 pLXSN-AS(+)的筛选结果(0.8%琼脂糖凝胶)1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ标样；2.重组子1+HindⅢ；3.重组子2+HindⅢ；4.重组子3+HindⅢ2 pLXSN-AS(+)的限制性酶切分析结果(0.8%琼脂糖凝胶)1.pLXSN-AS(+)无酶对照；2.pLXSN-AS(+)+BamHⅠ；3.pLXSN-AS(+)+HindⅢ；4.pLXSN-AS(+)+EcoRⅠ；5.pLXSN-AS(+)+EcoRⅠ+HindⅢ；6.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ标样pLXSN-AS(+)经大量扩增，限制性酶茏?汲?dr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入耐药的膀胱癌细胞系BHA-60中，观察反义核酸对MDR的逆转效应。
报告如下。
材料与方法一、材料1、BIU-87 细胞：人膀胱癌移行上皮细胞系，引自北京医科大学泌尿外科研究所。
BHA-60细胞为本实验室应用转基因方法建立的多药耐药细胞系［1］。
2、pLXSN：逆转录病毒载体，在其多克隆位点上游含启动子5’- LTR，在其多克隆位点下游含SV-40启动子和Neo基因，由美国Miller教授惠赠。
质粒pHDR5A由美国Gottesman教授［2］惠赠。
3、主要试剂：（1）脂质体（DoTap）、TriPure(tm) RNA提取试剂盒、DNA快速连接试剂盒，购自德国Boehringer Mannheim公司。
（2）G418为美国Gibercol BRL公司产品，用20mmol/L的HEPES稀释成100μg/μl，0.2μm过滤器过滤除菌，分装后保存于-20℃备用。
二、方法的孵箱中培养，培养液为含有10%1、细胞培养：细胞置于37℃，含5%CO2新生小牛血清的RPMI-1640。
2、反义核酸质粒的构建：用EcoR I酶切质粒pHDR5A，获得1 383bp长的mdr1 cDNA；逆转录病毒载体pLXSN经EcoR I酶切后经CIAP脱磷酸化，制备线性化载体，将mdr1 cDNA与线性化pLXSN载体连接，经氨苄青霉素抗性筛选，再用Hind Ⅲ酶切鉴定1 383bp mdr1 cDNA的插入方向，克隆出正向插入1 383bp mdr1 cDNA的逆转录病毒质粒pLXSN-AS （+），该质粒能在细胞内表达长1 383nt的mdr1 mRNA的反义RNA。
3、逆转录病毒质粒pLXSN-AS（+）对细胞BHA-60的转染：按说明书进行操作。
选择性培养基为含G418（终浓度为800μg/ml）的1640培养基，定期更换新鲜培养液，共选择培养14～16天，长出肉眼可见克隆，该细胞系命名为BHA-AS。
同时用pLXSN作为空载体转染对照。
4、细胞耐药性及细胞对ADM、COLZ〗讨论20多年前，当人们首次在微生物体内发现基因表达过程中出现RNA-RNA互补现象时，提出了任何基因的功能都可以通过反义核酸加以抑制的假设［5］。
1978年Hastic等［6］首先在体外实验中实现这一假设，Zameenik等［7］应用反义寡核苷酸（aODN）在Rous肉瘤病毒复制研究过程中实现了细胞培养条件下的基因阻断。
反义核酸阻断基因表达的机制是与靶RNA以碱基互补原则相结合，形成的DNA-RNA复合物是细胞内RNA酶H的作用底物，易被RNA酶H所破坏，另一方面，DNA-RNA复合物和RNA-RNA复合物阻断了mRNA的转录或mRNA与某些转录蛋白质相结合，从而抑制蛋白质的合成［8］。
Quattrone等［9］将10mmol/L的18mer的aODN与人源性大肠癌细胞系共同孵育15天，结果该细胞系的耐药性下降50%。
Tominaga等［10］在研究P-GP 与氯离子通道活性时也发现aODN能显著降低P-GP的合成。
尽管aODN有易于合成和较高阻断活性等特点，但对导入的aODN数量要求较高，且多为短期效应。
本实验将mdr1 cDNA 1 383bp片段亚克隆于逆转录病毒载体pLXSN上，重组出能在细胞内转录出反义核酸的逆转录病毒质粒，该质粒经导入到靶细胞后能在细胞内转录出1 383nt的mdr1 mRNA反义核酸。