【精选】抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选 doc资料
中草药提取物体外抗乙型肝炎病毒活性的筛选
中草药提取物体外抗乙型肝炎病毒活性的筛选[摘要] 目的从31种中草药醇提物中筛选出具有抗hbv活性的药物。
方法 60%乙醇回流提取药物醇提物；用四甲基偶氮唑盐比色法检测药物对细胞的毒性；采用酶联免疫法检测细胞培养上清液的hbsag和hbeag；用治疗指数判断药物的抗hbv作用。
结果实验发现，槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草等5种中草药具有一定的抗hbv活性，半数有毒浓度分别为83.2、926.5、509.9、477.7和577.7 μg/ml；最大无毒浓度时，5种药物对hbeag的抑制率分别为52.9%、63.7%、78.1%、56.8%和66.3%，对hbeag的半数抑制浓度为29.7、34.4、42.1、91.4和27.8 μg/ml，治疗指数分别为2.8、26.9、12.1、5.2、20.8。
结论槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺和溪黄草抗hbv效果较好，有进一步研究的价值。
[关键词] 中药提取物；乙型肝炎病毒；hepg2 2.2.15细胞；hbsag；hbeag[中图分类号] r285.5 [文献标识码] a [文章编号] 2095-0616（2013）05-37-05乙肝病毒（hbv）属嗜肝dna病毒，感染hbv后不仅会引起急、慢性肝炎，而且还可能导致原发性肝癌[1-2]。
在我国，至少有一半以上的人感染过乙肝病毒，严重的危害着人民的健康[3]。
干扰素与核苷类似物是目前国内外公认的抗乙肝药物，已大量用于治疗慢性乙肝。
但干扰素副作用较大，而核苷类易引起病毒变异，导致治疗效果下降[4-5]，因此，研究抗hbv药物已成为治疗乙型肝炎的重中之重。
我国中草药资源丰富，实践表明许多天然药物不仅具有明确的治疗乙型肝炎的作用，而且毒性低，副反应小，从中分离提取活性成分已成为当前新型抗乙肝药物研发的热点之一。
但由于hbv宿主仅限于人和类人猿，不适于动物模型的建立[6]。
为此，camille等[7]于1986年将hbv基因组转染至人肝癌细胞株hepg2，经g-418筛选得到细胞克隆，建立了hepg2 2.2.15细胞株，已被国内外作为抗乙肝药物筛选的细胞模型，大量应用于药物的筛选研究[8-12]，且已经成为申报肝炎新药必具的抗病毒实验模型[13]。
以Survivin为靶点的反义寡核苷酸在肝癌研究中的应用进展
体内肉芽组织新生血管中表达较高，提示Ｓｕｒｖｉｖｉｎ可 能在血管形成的中间环节发挥重要作用。Ｍｅｓｒｉ 等［３一用Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ＡＳ（）ＤＮ作靶向治疗，可以抑制 ＶＥＧＦ介导的内皮细胞保护作用，促进血管内皮细
胞的凋亡和血管的退行性改变。提示，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ可
２
献
Ａ ｎｏｖｅｌ
ａｎｔｉ—ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｎａｔ
Ａｍｂｒｏ ｓｉｎｉ Ｇ，Ａｄｉｄａ Ｃ，Ａｌｔｉｅｒｉ ＤＣ． ｇｅｎｅ．ＳｕｒＶｉＶｉｎ・ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
１９９７．３：９１７—９２１． Ｚａｆｆａｒｏｎｉ ｎｅｗ Ｎ，Ｐｅｎｎａｔｉ ｉｎ
ｃａｎｃｅｒ
ａｎｄ
ｌｙｍｐｈｏｍａ．
Ｍｅｄ，
Ｍ。Ｄａｉｄｏｎｅ ＭＧ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ Ｊ
３反义寡核苷酸技术及其封闭Ｓｕｒ’ｒｉｖｉｎ靶向治疗 的意义
家族中最小的。它的结构非常独特，其Ｎ端只含有 一个杆状病毒ＩＡＰ重复序列（ＢＩＲ），这是其发挥抗 凋亡作用的关键结构域；其羧基末端不含锌指结构 而代之以一个ａ螺旋结构，后者是Ｓｕｒｖｉｖｉｎ与微管 相互作用调节细胞周期的关键位点。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是迄 今为止发现的作用最强的凋亡抑制因子，它可能通 过抑制终末效应因子ｃａｓｐａｓｅ－３和ｃａｓｐａｓｅ－７来干扰
意义。
参考文
１
近年来研究发现，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达可能与化学治疗
耐药有关［１ ６｜。通过反义技术封闭Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的过表
达诱导细胞凋亡，可能干预肿瘤耐药的产生，增强 化学治疗敏感性‘”］。Ｇａｏ等‘”３以脂质体为载体，用
ＡＳＯＤＮ封闭人肝癌耐药细胞株ＳＭＭＣ一７７２１／
ＡＤＭ的Ｓｕｒｖｉｖｉｎ后，肝癌细胞的生长受到明显抑 制，而联合应用化学治疗药物阿霉素（ＡＤＭ）后细胞 的生长抑制作用更为明显，认为ＡＳ（）ＤＮ能降低肝 癌耐药细胞Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达，增强人肝癌耐药细胞 对ＡＤＭ的化学治疗敏感性。另有学者认为一…，
反义锁核酸体外抗乙肝病毒的实验研究
基 因的 反 义 Ｉ ＮＡ 能 显 著 抑 制 Ｈｅ ｐ Ｇ ２ ． ２ ． １ ５细 胞 表 达 ＨＢ ｓ Ａ ｇ （ Ｐ ％０ ． ０ ５ ） 且 第 ３天 出现 抑 制 高 峰 ， 抑 制作用随 时间 延 长 逐 渐 减 弱 。反 义 锁 核 酸 组 对 ＨＢ ｓ Ａｇ及 细 胞 内 、 细 胞 外 ＨＢ Ｖ Ｄ ＮＡ 均 有 较 强 抑 制 作 用 ， 最 高抑 制 率 分 别 为 ５ １ ． １ ９ 、 ５ ６ ． ７ ３ 、 ８ ６ ． ９ ， 与 其 他 实验 组 相 比 差 异 有 统 计 学意 义（ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 与对照组比较差异 有统计 学意义（ Ｐ＜
ｏ ｇ ｙ， Ｇｕ ａ ｎ ｇｚ ｈ ｏ ｕ Ｍｅ ｄｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ。 Ｇｕ ａ ｎ ｇｚ ｈ ｏ ｕ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ５ １ ０ ４ １ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔｏ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｏ ｒ ｙ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｎ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｔ ｉ ｓ Ｂ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ （ ＨＢＶ）ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｂ ｙ ｌ ｏ ｃ ｋ ｅ ｄ
反义核酸抑制肝癌细胞生长的研究进展
ＮＡ）是一种细胞增殖必须的核抗原，是ＤＮＡ聚合酶８的重 要辅助因子，在ＤＮＡ复制、细胞增殖和细胞周期调控中发挥 重要作用，出现在所有增殖期的细胞核中，在细胞进入ｓ期 时表达，而处在Ｇ。／Ｇ。期细胞则基本不表达，因此将其作为 细胞增殖的标志‘引。ＰＣＮＡ在肝癌中呈高表达，与肝癌的分 期、分级以及预后有密切相关∞－４ｊ。将ＰＣＮＡ作为反义核酸 治疗的靶分子，特异性封闭ＰＣＮＡ基因表达，阻断ＤＮＡ合成 的共同通路，能够达到抑制肝癌细胞增殖的目的。ＰＣＮＡ反 义寡核苷酸序列与ＰＣＮＡ ｍＲＮＡ中ＡＵＧ起始密码子后的１８
பைடு நூலகம்ＤＮＡ
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ＯＮＤ：５’一ＣＣＴＧＣＡＴＡ７ｒｃＡＧ从Ｇ从ＧＣＣＡＴ一３乞反义Ｓｔａｔｈ－
ｗｉｎ核酸反义寡脱氧核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉ－
ｄｅ，ＡＳＯＤＮ）具有抑制ＳＭＭＣ－７７２１细胞生长的作用，而Ｓ・ ＯＤＮ（眈１１８ｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＳＯＤＮ）无此作用。细胞 周期分布分析，ＡＳＯＤＮ作用后首先表现为Ｇ：／Ｍ期的阻滞， 在Ｇ，峰前出现凋亡小峰（ＡＰ峰），随后Ｇ２／Ｍ逐渐减少，ＡＰ 逐渐增多。ＡＰ峰的出现表明细胞ＤＮＡ降解、渗漏，导致 ＤＮＡ染色能力下降，提示凋亡的发生。ＡＳ－ＯＤＮ对ＳＭＭＣ・ ７７２１的生长抑制作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。
某些肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有 关，它们都是正常细胞内存在的，其编码的产物多为信号传 导系统中的某些效应分子。癌基因和抑癌基因及它们的产 物在细胞正常生长和分化中发挥重要作用，他们的突变会造 成信号系统的紊乱，影响细胞的正常生命过程，从而引起肿 瘤。特别是某些癌基因编码生长因子或其受体，并以自分泌 的形式作用于瘤细胞，促进其生长，这是某些肿瘤无限生长 的分子基础。因此，许多学者企图用反义核酸抑制癌基因的 表达或自分泌生长因子的分泌或封闭其受体，来研究反义核 酸在肿瘤治疗中的作用。反义基因疗法是目前肿瘤基因治 疗中的一个重要方面。反义基因治疗就是应用反义核酸在 转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断细胞内 异常信号的传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋 亡‘¨。 反义核酸包括三类：一类是将特异的反义基因连到特定 的表达载体上（质粒、病毒），导人靶细胞直接转录出反义 ＲＮＡ，与相应的ｍＲＮＡ形成双链，阻止ｍＲＮＡ作为模板进行 翻译而发挥作用。另一种类型的反义核酸是人工合成的寡 脱氧核苷酸（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），在机体内以胞吞的方式进 入细胞，与相应的ｍＲＮＡ结合发挥作用。第三种类型是核 酶，为一种具有催化活性的反义核酸，其与相应的ｍＲＮＡ结 合后能发挥酶活性将ｍＲＮＡ降解。反义核酸不仅能作用于 ｍＲＮＡ，阻止翻译过程，而且能特异地抑制转录过程。寡聚核 苷酸可以直接结合ＤＮＡ双链的特定部位，形成三聚体影响 转录因子的结合，使转录过程不能启动。寡聚核苷酸形成的 双链竞争转录因子的结合。
反义寡核苷酸(aso)实验方法
反义寡核苷酸（aso）实验方法反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）是一种具有反向互补碱基序列的寡聚核苷酸序列。
反义寡核苷酸通过与目标RNA 的特定区域序列互补结合，阻断RNA的转录、剪接、翻译或稳定性，从而通过抑制特定基因的表达来实现治疗目的。
在研究领域中，反义寡核苷酸也被广泛用于研究基因功能、疾病发生机制以及药物开发等方面。
实验方法：一、设计反义寡核苷酸序列设计反义寡核苷酸序列是使用反义寡核苷酸进行研究的第一步。
首先，需要选择目标基因的靶点序列。
最常见的靶点是靶向mRNA的编码区域，因为这对于阻断目标基因的蛋白质合成具有最高的效率。
接下来，需要通过一系列计算和筛选程序，选择反义寡核苷酸序列。
设计时需要考虑反义寡核苷酸的长度、GC含量、碱基组成和互补性等因素。
最有效的反义寡核苷酸序列应该具有高亲和力和特异性，同时应避免与非目标RNA序列的配对。
二、合成反义寡核苷酸合成反义寡核苷酸是实验的下一步。
反义寡核苷酸可以通过化学合成方法合成。
合成方法通常采用固相合成技术，其中核苷酸分子通过添加保护基和活性基团的方法，逐个添加到固相载体上。
合成出的反义寡核苷酸需要进行纯化和鉴定，以确保其合成质量和纯度。
三、体外细胞实验在体外细胞实验中，需要将反义寡核苷酸转染到目标细胞中。
转染方法包括化学转染、电转染和病毒载体介导转染等。
转染后，反义寡核苷酸被细胞摄取，并与目标RNA互补结合。
这种结合可以通过碱基配对识别机制实现，从而形成反义寡核苷酸与mRNA的双链结构。
双链结构的形成抑制了mRNA的翻译或通过RNA酶降解机制降解mRNA。
实验人员可以通过多种实验方法，如PCR、Western blot和细胞荧光染色等，验证目标基因的表达是否被抑制。
四、动物模型实验在动物模型中进行反义寡核苷酸的实验需要将合成的反义寡核苷酸注射到动物体内。
这可以通过不同的途径实现，如静脉注射、肌肉注射和腹腔注射等。
以Survivin为靶点的反义寡核苷酸在肝癌研究中的应用进展
性 的患者 ， 复发率 高 于表达阴性 者 ， １ 其 年和 ３年生 存 率也显 著降低 。以上结 果表 明 ，ｕｖ ｉ 肝癌 中 Ｓ ｒｉ ｎ在 ｖ
呈 特 异 性 高 表 达 ， 不 但 促 进 肝 癌 细 胞 增 殖 、 制 凋 它 抑 亡 ， 与肝 癌 的发 生 、 展及 预 后 密 切相 关 。因此 ， 且 发 Ｓ ｒｉｉ 能 成 为 肝 癌 基 因治 疗 研 究 中 的新 靶 点 。 ｕｖ ｎ可 ｖ ３ 反 义 寡 核 苷 酸 技 术 及 其 封 闭 Ｓ ｒｉｉ ｕｖｖｎ靶 向 治 疗 的 意 义 反 义核酸技 术是 一 种新 兴 的基 因治疗 技 术 ， 是 ｃ ＮＡ 在人类基 因组 中筛选 克隆 出来 的 。该基 Ｄ
因定 位 于 染 色 体 １ ｑ ５ 全 长 １． ｂ 含 ４个 外 显 ２， ７ ４ ７ｋ ． 子 和 ３个 内含 子 。 Ｓ ｒｉｉ 因 编 码 产 生 的蛋 白 由 ｕｖｖｎ基 １２个 氨 基 酸 组 成 。 对 分 子 质 量 为 １ ０ ， Ｉ ４ 相 ６５ ０ ９卷
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以 Ｓ ｒｉｉ ｕｖｖｎ为靶点 的反 义寡 核苷 酸在 肝癌研 究 中的应 用进 展
钱 瑾 孟 立 娜
摘要 ： ｕｖｖｎ是 目前恶性 肿 瘤 基 因治 疗研 究 中的新 靶 点 。采 用 反 义 寡核 苷 酸 等 治 疗 方 法 可 以抑 制 Ｓ ｒｉｉ Ｓ ｒｉｉ ｕ ｖｖｎ的表达 ， 而诱 导肿瘤 细胞的 凋亡 、 制 细胞 增 殖并增 强 对化 疗 药物 的敏 感性 。近 年 来 ， 从 抑 已有 学者
表达具 有细 胞周期 依 赖性 ， 主要 在 Ｇ ／ 期 大量 表 ２Ｍ
反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的研究进展
反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的研究进展
邱梦标;张吉翔
【期刊名称】《国际流行病学传染病学杂志》
【年(卷),期】2003(030)005
【摘要】反义寡核苷酸(ASODN)是近十年来迅速发展起来的一种新的生物技术.它为乙型肝炎病毒(HBV)治疗提供了一种新的基因治疗途径.本文就ASODN抗HBV 的研究进展:ASODN抗HBV的反义与非反义作用机制研究;ASODN的化学修饰;针对HBV各基因区关键位点的ASODN抗HBV效果评价以及利用联合或串联ASODN和靶向技术抗HBV作用的研究分三部分进行综述.
【总页数】3页(P295-297)
【作者】邱梦标;张吉翔
【作者单位】江西医学院第二附属医院消化内科,330006;江西医学院第二附属医院消化内科,330006
【正文语种】中文
【中图分类】R511
【相关文献】
1.脂质体介导反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒作用的研究 [J], 陈启荣;邵俊斌;印慧;喻诤琴
2.阳离子脂质体对反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒作用的促进 [J], 严文伟;齐宪荣;魏来;费然;王宇
3.抑制核转录因子PPARα的反义寡核苷酸的抗乙型肝炎病毒活性研究 [J], 吴小
桃;杨静;王学军;李丹丹;李英;鲁丹丹;王升启
4.核苷(酸)类药物抗乙型肝炎病毒治疗停药相关研究进展 [J], 朱旭庆;尹春煜
5.抗乙型肝炎病毒药物研究进展与发展趋势 [J], 贺珍凤;臧林泉
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乙肝病毒e抗原与肝纤维化以及反义寡核苷酸对乙肝病毒的抑制的开题报告
乙肝病毒e抗原与肝纤维化以及反义寡核苷酸对乙肝病毒的抑制的开题报告研究背景：乙型肝炎病毒（HBV）是一种在全球范围内广泛存在的病毒，它会导致肝炎、肝硬化和肝癌等疾病。
HBV治疗过程中，肝功能的衰竭以及病毒复制的持续进行，都会导致肝纤维化的发生。
乙肝病毒e抗原（HBeAg）是HBV病毒的一个标志性蛋白，对HBV的复制和传播起着重要的作用，而HBeAg的高水平表达与乙肝患者的恶性转化密切相关。
因此，对HBV病毒复制的抑制和HBeAg表达的调控都成为了乙肝治疗研究的热点问题。
近年来，研究发现反义寡核苷酸（anti-sense oligonucleotide，ASO）对HBV具有良好的抑制作用，ASO适用于针对特定信使RNA序列，对特定蛋白进行特异性靶向干扰，可有效地降低HBeAg的表达及抑制病毒复制，因此是目前治疗病毒性疾病的一种有效手段。
研究目的：本研究旨在探究HBeAg与HBV病毒的复制之间的关系，以及ASO对HBeAg表达和HBV复制的抑制作用，为乙肝治疗提供新的理论依据和治疗方式。
研究方法：1.选择乙肝病毒HBeAg阳性患者血样进行研究，检测HBeAg及相关指标。
2.建立乙肝病毒的细胞模型，检测不同浓度的ASO对HBeAg及HBV 复制的抑制作用。
3.采用Western blotting和Real-time PCR技术检测不同浓度ASO对HBeAg及HBV复制的抑制程度，并分析其特异性。
4.通过建立动物模型进行ASO的体内药效学评价，为ASO临床应用提供科学参考。
研究意义：研究结果有助于深入理解HBeAg与HBV病毒的复制之间的关系，在治疗乙肝病毒方面提供新的理论依据，并为临床提供一种新型的治疗乙肝病毒的方案，具有重要的临床应用前景。
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抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选摘要：目的寻找抗HBV最佳反义寡核苷酸区段。
方法合成4种互补于HBV不同区段的反义硫代寡核苷酸（asON），加入HBV基因转染的肝癌细胞模型HepG2.2.15，以ELISA法测定HBsAg、HBeAg含量。
结果互补于pre-S2翻2译起始区的asON（序列Ⅰ）抗HBV基因表达作用最强(P<0.02)，对HBsAg、HBeAg的最高表达抑制率分别为66%和91%,针对增强子Ⅱ(ENⅡ)的序列Ⅲ也有较强的抑制作用（52%、56%）。
asON抗HBV作用具有明显时相性，其抑制作用随时间延长而有反跳，且针对增强子Ⅱ的反义序列Ⅲ和针对S基因起始区的反义序列Ⅱ的抑制作用规律相似，并在时相上与序列Ⅰ互补。
结论4种asON 中，序列Ⅰ抗HBV基因表达作用最强，而且序列Ⅰ与Ⅲ或Ⅱ配伍有望成为理想的抗HBV基因药物。
关键词：乙型肝炎病毒；反义寡核苷酸；基因表达Comparison of the anti-HBV effect of various antisenseoligodeoxynucleotidesMA Chunhong（）SUN Wensheng（）LIU Suxia, et al（）Abstract：Objective To explore an effective anti-HBV oligodeoxynucleotide. Methods Four antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides (asON), complementary to different sites of HBV, were synthesized and assayed for their anti-HBV activity in HepG22.2.15 cells with ELISA. Results The oligomer directed against the initiator of pre-S2 (No.Ⅰ) was most effective, with an inhibitory rate of 66% on HBsAg and 91% on HBeAg (P<0.02). The decrease in virus production was time-dependent. The asON, complementary to enhancer Ⅱ (No.Ⅲ), or asON directed against initiator of S gene (No.Ⅱ) together with asON (No.Ⅰ) had an co-inhibition effect on HBV gene expression. Conclusion asON directed against initiator of S gene had a strong inhibition effect on HBV and asON (No.Ⅰ), or asON (No.Ⅰ) together with asON( No.Ⅲ /Ⅱ) had a therapeutic potential in the treatment of patients infected with HBV.Key words：Hepatitis B virus；Antisense；Oligodeoxynucleotides; Geneexpression▲乙型肝炎病毒（HBV）感染可致肝炎乃至肝癌，严重威胁人类生命健康，目前尚无有效治疗方法。
近年来发展的反义核酸技术利用碱基互补配对原则，定向阻断特定基因的复制、转录或翻译，从核苷酸水平破坏病毒，在新一代抗病毒、抗肿瘤药物设计领域中具有巨大发展潜力。
国内外学者以反义寡核苷酸(asON)作为基因封条封闭HBV ，取得良好的抑制效果〔1-3〕。
但由于asON的抑制作用具有序列特异性，如何选择靶位点，设计最佳基因封条，并掌握其抑制作用规律，成为以反义技术抗HBV基因治疗的关键。
我们综合国内外学者的工作，选择设计了4种反义寡核苷酸片段，加入HBV DNA转染的肝癌细胞模型2.2.15)，初步筛选出最佳asON，并对其HBV的作用规律进行了探讨，(HepG2旨在为反义技术用于HBV治疗奠定基础。
材料与方法2.2.15整合有HBV基因组，能转录、翻译HBV基细胞：肝癌细胞系HepG2因，并产生HBsAg、HBeAg和Dane particle。
该细胞株引自北京医药生物研究条所，本室传代培养于含G418和10%胎牛血清的MEM培养基中，37℃ 5% CO2件下，3～4 d换液1次，细胞长满后传代。
当培养上清中HBsAg、HBeAg稳定分泌，且P/N值>5时，用于实验。
试剂：MEM培养基、胎牛血清为GIBCO产品；G418为Sigma产品；HBsAg、HBeAg检测试剂盒为深圳月亮湾公司产品。
反义寡核苷酸的合成：选择互补于HBV的4个基因位点作为研究对象，即：序列Ⅰ针对pre-S2基因（pre-S2）翻译起始区（3 203～3 219）；序列Ⅱ互补于S基因翻译起始区（147～163）；序列Ⅲ针对HBV转录调控成分增强子Ⅱ（ENⅡ）（1 713～1 727）；序列Ⅳ针对X基因起始区（1 373～1 391）；其中序列Ⅲ是我们自行设计的asON，在国内外尚无报道。
同时设置HBV非互补随机序列Ⅴ(5′TTG CCG AGC GGG GTA3′)作为对照，此序列经微机检索与HBV DNA无同源性。
上述寡核苷酸片段由中国军事医学科学院合成，并进行硫代修饰，其纯度>99%。
4/孔接种于96孔板。
第2天细胞贴壁asON对病毒抗原的抑制实验：HepG2后弃培养基，加入含不同浓度反义/正义寡核苷酸MEM培养基，每个浓度设3孔重复，同时设空白对照（不加寡核苷酸）。
作用一定时间后收集上清，以ELISA HBsAg、HBeAg含量。
计算反义核酸对病毒抗原的抑制率。
反义核酸细胞毒性试验：通过细胞计数、细胞活率及细胞形态学观察,了解asON的细胞毒性作用;MTT比色法测定asON对细胞代谢的影响情况。
结果2.2.15细胞经10μmol/L的1．asON抑制病毒抗原表达作用的比较：HepG2反义寡核苷酸一次性作用后,其病毒抗原表达被抑制的情况如表1所示。
序列Ⅰ～Ⅳ均可有效抑制HBsAg、HBeAg的表达，其中除针对S基因起始区的asON （序列Ⅱ）对HBeAg表达的抑制作用稍弱(31%)外,其余针对pre-S2翻译起始区、增强子ENⅡ及X基因起始区的序列（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ）对HBsAg、HBeAg均有较强抑制作用（>50%），尤以针对pre-S2翻译起始区的序列Ⅰ作用最强（P<0.02），对HBsAg、HBeAg表达抑制率分别为66%和91%；互补于ENⅡ的序列Ⅲ与针对X起始区的序列Ⅳ对HBsAg、HBeAg的抑制作用相似，分别为52%、57%和56%、56%；对照序列Ⅴ对病毒抑制作用极弱（<12%）。
2．asON抑制作用的时相性：以10μmol/L的不同序列反义寡核苷酸一次2.2.15，作用后每隔24 h取上清，测抗原含量，持续观察至第性作用于HepG27天。
结果发现asON抗病毒作用具有明显时相性，表现在：①asON出现最佳抑制作用的时间不同，②同一序列反义核酸对HBsAg、HBeAg的最佳抑制作用时间不相同，序列Ⅰ对HBsAg、HBeAg的最高抑制率分别出现在第2、1天（见表1）。
③反义寡核苷酸在持续作用HepG2.2.15的过程中，对病毒基因表达的2抑制作用有双峰现象：在作用的7 d中，各反义序列均出现2次强的抑制作用，即有2个峰值，但不同asON峰值出现时间不同。
我们所做4个序列的第二峰均出现于作用后第5～7天，此时细胞已基本长满，逐渐开始形成集落。
表1 不同反义核酸对HBV基因表达的抑制作用Table 1. Inhibition of HBV gene expression byoligodeoxynucleotidesHIE:Highest inhibitory effect,*：Time of highest inhibitory effect3. 不同反义寡核苷酸抑制作用互补：如1，2所示，在7 d的作用过程中，针对S基因、ENⅡ的反义序列（Ⅱ、Ⅲ）抑制作用规律相似，对HBsAg的抑制峰值出现于5、7 d，对HBeAg的抑制峰值出现于1、6/7 d；而且序列Ⅱ、Ⅲ的抑制作用恰好与序列Ⅰ互补，序列Ⅰ对HBsAg抑制作用在低谷时（4～5 d），序列Ⅱ、Ⅲ的抑制作用达高峰，而当序列Ⅱ、Ⅲ对HBeAg的抑制作用较弱时（5、6 d），序列Ⅰ的作用正处于第二个峰值。
1 不同反义核酸对HBsAg表达的协同抑制作用Fig 1. Co-inhibition of HBsAg by oligodeoxynucleotides2 不同反义核酸对HBeAg表达的协同抑制作用Fig 2. Co-inhibition of HBeAg by oligodeoxynucleotides4. 反义核酸对细胞无毒性作用：以20μmol/L，40μmol/L的反义寡核苷2.2.15，镜下观察显示4种反义序列作用的细胞在形态、数目酸作用于HepG2（总数、活细胞数）较正常无明显变化，MTT结果表明asON对细胞的细胞毒指数<5%,即反义序列对细胞代谢无影响。
讨论反义技术从核苷酸水平破坏HBV，阻断HBV抗原的产生，从而防止由病毒抗原引发的免疫病理对机体造成的伤害，是抗HBV治疗的有效途径。
HBV基因组全长3.2kb，有至少4个开放读码框，如何从中筛选最佳靶位点，设计最佳反义寡核苷酸区段至关重要。
考虑到HBsAg为HBV主要抗原，在其致病机制中有重要地位；pre-S2基因参与HBsAg的编码，同时又是反式激活蛋白；而HBx 的整合与肝细胞癌关系重大〔4〕，而且国内外学者针对S基因、pre-S2、X基因设计的asON对HBsAg、HBeAg均有较好的抑制作用〔2，3，5〕，我们设计合成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，以比较它们对HBV的抑制作用。
另外，我们根据转录调控成份增强子Ⅱ（ENⅡ）设计合成了序列Ⅲ，试通过阻止ENⅡ的作用，使HBsAg、HBeAg 及HBxAg表达量下降。
目前作者尚未见针对该区段设计寡核苷酸的报道。
体外实验表明，合成的4个反义序列对HBsAg、HBeAg表达均有抑制作用，其中针对pre-S2起始区的序列Ⅰ作用最强（P<0.02），尤其是序列Ⅰ对HBeAg 表达的抑制率高达91%，证明序列Ⅰ有效抑制了HBV DNA的复制，是一个理想的抗HBV反义寡核苷酸区段。