HE染色与免疫组织化学染色实验报告

华中农业大学动物科技动物医学院

HE染色与免疫组织化学染色实验报告

1实验目的及意义

1.1了解石蜡切片的制作过程

1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法

1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识

2 实验方法及步骤

2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤

2.1.1取材与固定：

从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2.1.2脱水透明：

一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

2.1.3浸蜡包埋：

将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

2.1.4切片前的准备工作：

先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。

2.1.5切片与贴片：

将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。2.1.6 脱蜡至水

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二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.7染色：

苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.8脱水和透明：

95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.9封固：

将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37℃烘箱。

2.2 SABC 染色步骤

2.2.1脱蜡至水：

二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ15分钟，100％酒精2分钟，95％酒精2分钟，80％酒精2分钟，70％酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.2.2流水冲洗5分钟（水流要小）

2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。

2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。

2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01M枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。

2.2.6取出切片放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.7取出切片放入湿盒中，滴加5%BSA封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。

2.2.8甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加PBS,放入4℃冰箱过夜。

2.2.9放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。

2.2.11取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。

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2.2.12取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.13 DAB显色，取一试管加1ml单蒸水，B、C、A试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。

2.2.14终止显色用单蒸水洗5分钟，重复2次。

2.2.15苏木素衬染1分钟，流水冲洗5分钟。

2.2.16脱水透明，70％酒精3分钟，80％酒精2分钟，90％酒精2分钟，95％酒精2分钟，95％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅰ2分钟，100％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅲ2分钟二甲苯Ⅰ8分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.2.17中性树胶封片，放入37℃烘箱。

3 实验结果

3.1 HE 染色结果

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A

IB

B

IB

IB：狂犬病毒包涵体（内基氏（Negri）小体）

图1 狂犬病毒感染后脑组织病变 HE染色

A: 小脑浦肯野细胞内包涵体x400; B: 脑神经元内多处包涵体x400

狂犬病的病理变化在显微镜下主要表现为神经元退变,淋巴细胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖以及特征包涵体形成。狂犬病毒包涵体又称为内基体，直径

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约3～10nm，边缘整齐，内有1～2个状似细胞核的小点,主要出现在大脑海马区及小脑，其他部位也可见，在病变神经元胞浆内成圆形或卵圆形，苏木素一伊红染色脑组织切片中呈嗜酸性反应，病变神经元可含包涵体。大脑海马区神经元和小脑浦肯野细胞胞浆内检出狂犬病病毒包涵体，伴脑组织淤血、水肿。神经元变性．

A B

CP

C D

CP：豆状囊尾蚴虫卵的壳

图2 肝脏与肾脏的病变 HE染色

A: 豆状囊尾蚴在肝脏形成包囊x200; B: 脑神经元内多处包涵体x400 C：肾小管结构模糊，破坏x200; D: 肾小管上皮从基底膜脱落x400