免疫组织化学染色注意事项
免疫组织化学染色存在的问题及解决方案
【 ４ 】 舒冬利 ．陆利萍． 手术 标本 的程序 化管 理［ Ｊ ］ ． 中华护理杂志 ，
２ ０ ０ ９ ， ４ ４ （ ６） ： ５ ４ ６ — ５ ４ ７ ．
２ ． ２ ． ６ 标本管理 ： 严格执行 标本 管理制度及核对制度 ， 实行标 本程序化管理 。主刀医生让家属看完标本后 ， 巡 回护士立 即 装 入写有患者完整信 息的标本袋 ， 并群 呼标本接 收人 员即时
液， 但禁 止在走廊输入 预防性抗生素 和麻醉术前药 。 并 告知患 者， 输 液期间身体若有 任何 不适 ， 立即告诉走廊里走过的任何
一
个人 ， 巡 回护士要 每隔几分钟查 看患者一 次。前一 台患 者
离开手术 间并 清理完卫生后 ， 连台患者再进 入手 术间输入抗
术室管理 的重点 ， 严格执行各项规章制度和技术操作规范 ， 提 高手术室护理人员隐患防范意识 ，养成 良好 的工作作风和习
会使组织扭 曲变得过分脆硬 ， 抗原减少或定位不准 ， 亦使免疫
（ 收稿 日期 ： ２ ０ １ ７ － ０ ２ － ０ ３ ）
免疫组织化学染色存在 的问题及解决方案
何新明 顾 霞 郭 文婷 林毅 妍 岳 永亮
２ ０世 纪 பைடு நூலகம் ０年代免疫组织化学 技术应用 于病 理诊断 ，目
前肿瘤 的病理诊 断应用最为广泛㈣。免疫组织化学染 色切 片
质 量 影 响 结 果 的判 断 ，由 于 免 疫 组 织 化 学 染 色 过 程 繁 杂 ， 步
有研 究表 明 ， 在延迟 ４ ８ ｈ 后 进行 固定 ， 免疫 组织化学 染色基
本看不到 明确 的膜 阳嗍 。尽 量缩短延迟 固定时间。 １ ． １ ． ２ 固定时 间的长短对组织抗 原的活性 的影 响：固定时间 不足易造成 固定液不能完全渗透至组织 内部 ，固定时间过长
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点
免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，简称IHC）是在组织切片或细胞制片的基础上，通过利用特异性抗体与细胞或组织中特定分子间的特异性结合反应，以染色或标记方式来检测目标抗原的一种检测技术。
以下是免疫组织化学染色的一些基本知识点：
1. 抗体选择：根据实验目的选择合适的抗体，一般选择单克隆或多克隆抗体。
抗体可以是来自同种或异种动物，也可以是人源化的。
2. 组织或细胞预处理：包括固定、脱脂、脱水和切片等步骤，目的是保持组织或细胞的形态和结构完整，同时提高抗体的进入性。
3. 抗原解表：染色前需进行抗原解表处理，去除组织或细胞中的内源性酶等物质，以提高抗体的结合效率。
4. 特异性抗体结合：将经过解表处理的组织或细胞与选择的特异性抗体反应，抗体与目标抗原结合形成免疫复合物。
5. 二抗结合：特异性抗体结合后，使用与该抗体结合的二抗（常为抗种属免疫球蛋白）进行结合，放大信号。
6. 染色反应：根据具体实验的需要，可以选择不同的染色反应方法。
常用的染色方法有酶标法（如辣根过氧化物酶染色法，碱性磷酸酶染色法等）和免疫荧光染色法。
7. 结果观察和分析：观察染色结果，可以通过显微镜观察染色位置和程度，分析目标抗原在组织或细胞中的分布情况。
8. 数据分析和结果解读：根据染色结果，进行数据统计和分析，并结合实验设计和背景知识进行结果解读和推断。
总结：免疫组织化学染色是一种用于检测组织或细胞中特定抗原的技术，通过选择合适的抗体、预处理样品、特异性抗体结合、染色反应等步骤，可以获得目标抗原的位置和分布情况，并通过数据分析和结果解读来获取有效的实验结果。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化需要注意事项
免疫组化需注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
为达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。
如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。
四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。
新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。
我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。
免疫组织化学染色前的准备事项
免疫组织化学染色前的准备事项1.2 对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验；根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度。
1.3 抗体的原液应于分装后置于-20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价降低)。
1.4 抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。
1.5 抗体的稀释。
(1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。
(2)或用0.05M TBS(生理盐水三羟基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。
(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。
2被检测组织内抗原的修复2.1 经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。
进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。
有的抗体不需要进行抗原修复。
应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。
2.2 抗原修复缓冲液。
(1)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。
(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高pH值的EDTA(50mM Tris，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。
2.3 抗原修复的常用方法。
(1)胰蛋白酶消化法：①组织切片脱蜡、水化。
②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。
③37℃下温育20～40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。
④蒸馏水冲洗，终止反应。
⑤阻断内源性过氧化物酶。
⑥进行免疫组织化学染色。
[配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。
](2)胃蛋白酶消化法：①组织切片脱蜡、水化。
②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。
免疫组织化学技术操作规范及制度
免疫组织化学技术操作规范及制度
1．免疫组化技术员必须经过专门培训与考核授权后，才能进行免疫组化技术操作。
2、每一批次的免疫组化染色必须设阳性对照，可利用组织中的内对照。
3、必须建立本实验室每种免疫组化染色的操作规程，并及时更新。
4、更换抗体后，需要有用阳性和阴性组织进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2 年。
5、免疫组化染色过程中产生的有毒液体（如DAB）应专门回收，严禁随处倾倒。
6、病理医师必须熟悉各种抗体染色结果，阳性信号表达部位、其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。
7、单纯的免疫组化染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断。
8、免疫组化染色的质量要达到室间质评的合格标准。
9、通过实验室室内质控与室间质控，提高免疫组化染色的质量。
10、根据医学新进展，及时改进染色技术，提高免疫组化染色质量。
做好免疫组织化学染色的几个注意点
做好免疫组织化学染色的几个注意点免疫组织化学染色是一种常用的方法，用于检测组织和细胞中的蛋白质表达。
在进行免疫组织化学染色之前，需要注意以下几个方面，以确保染色的质量和准确性。
一、样本处理样本处理是免疫组织化学染色的关键步骤之一。
前期的样本处理将直接影响后期染色的效果。
一般来说，样本处理包括取材、固定、脱水、透明化、包埋、切片等步骤。
样本应该在取材后立即进行固定以防止蛋白质的损失和蛋白质异构体的变化。
同时，固定液中的药剂成分要根据不同蛋白质的特性进行选择，不同的药剂成分固定时间也应根据蛋白质的大小和分子量来进行优化调整。
二、抗体选择抗体是免疫组织化学染色的核心。
正确选择适宜的抗体对于染色结果至关重要。
在选择抗体时，应该注意以下几点：1、抗体应具有较高的亲和力和特异性，以确保染色的敏感性和选择性。
2、抗体的来源、克隆和浓度也很重要。
来源纯度应高于90%；与生物标本的物种有较高相似度的源（例如，兔、小鼠）的单克隆抗体效果更好。
浓度不能太高，否则会导致非特异性结合。
3、对于多蛋白共存的样本，应选择不同引物或标记抗体，以避免交叉反应。
三、标记物选择标记物的选择也影响到染色的结果。
多种标记物可应用于免疫组织化学染色，如酵素标记、荧光标记和金标记等，根据实验需要选择适当的标记物进行染色。
四、染色方法的优化免疫组织化学染色的过程需要进行优化，包括抗体浓度、背景消除步骤、染色时间和条件、固定剂和诱导剂浓度选取等等。
这些步骤都需要在实验室中进行研究和优化。
其中比较关键的是控制抗体浓度，以及对于背景的消除，可进行多次亲和吸附过程，获得更好的染色结果。
总之，免疫组织化学染色是一种重要的实验技术，它能够让我们观察到细胞和组织中蛋白质的分布和存在情况。
在实际应用中，我们需要注意样本的处理、抗体和标记物的选择以及染色方法的优化等关键步骤，以获得高质量的染色结果。
免疫组织化学染色的实验步骤及注意事项
十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。
3、自来水冲洗5min。
4、蒸馏水冲洗3遍。
5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。
6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。
7、PBS浸泡5min*3次。
8、3%的H2O2封闭30min。
9、蒸馏水冲泡2次。
10、PBS浸泡5min*3次。
11、加Ⅰ抗8张片子，每片80μl8*80=640μl
配700μl700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。
13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。
18、流水中止，流水冲洗5min。
19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。
20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。
21、二甲苯透明各15min。
22、用中性树胶封片。
盐酸酒精500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水600ml蒸馏水+2m氨水
氨水作用：返蓝。
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七、复染液复染过度。 八、重复使用抗原修复液。
九、显色试剂孵育时间过短或试剂配制错误。
一、抗原修复过度
二、一抗浓度过高，孵育时间过长，或孵育温
度过高。 三、二抗检测系统浓度过高，孵育时间过长或 孵育温度过高。 四、显色试剂孵育时间过长。 五、PBS缓冲液重复使用多次或冲洗不足。 六、使用错误的封闭血清。 七、切片粘附剂过厚。
一、组织边缘与
玻片黏贴不牢，经抗原热修复 或后续缓冲液冲洗后，造成边缘组织松脱浮在 玻片上方，每次冲洗时不易将组织下面的试剂 洗干净，导致此区域染色过深。 二、滴加试剂时，试剂未充分覆盖组织，导致 组织边缘无试剂或试剂很少，孵育时此区域容 易首先变干，造成浓度较中心组织高而导致染 色过深。
1、抗体稀释度过高，导致切片深染。
现象：无法分清细胞找色 解决办法：找出最佳的稀释比
一、抗原修复不当。
二、一抗与二抗检测系统匹配错误 三、实验操作错误
四、使用不合格的稀释剂
五、一抗选择错误。 六、一抗二抗检测系统、显色试剂被污染，失
效或已超过有效期。 七、二抗检测系统与显色试剂不匹配 八、抗原含量过低 九、试剂浓度过低，过高或不合适的孵育时间 和温度。
一、组织固定不及时，造成部分抗原弥散并遗
留在组织内。 二、取材时，由于使用钝的刀片，导致组织受 到人为挤压而变形，血清蛋白弥散并遗留在组 织内。 三、受测组织有部分坏死、损伤或压迫成分。 四、组织切片太厚。
一、阴性对照血清浓度不合适。
二、阴性对照血清被污染并与受测组织中的蛋
一、滴加试剂时，试剂未完全覆盖组织。
二、试验操作台不平或孵育盒不平，导致切片
有个倾斜度最终导致“阴阳脸”结果。 三、滴加试剂到组织上时存在气泡，却没有将 气泡除去。 四、组织固定时间过短，造成中心部位固定不 足。
组织前期处理不适当，如组织在二甲苯中浸泡
时间过长，固定液使用不当，组织变干，抗原 修复液的PH值和修复时间不当或修复过程中修 复液蒸发过多，造成最后部只需放在普通4℃ 冰箱内保存，保存时间可达5-10年以上（免疫荧光 试剂例外）。最好不要用塑料管分装，因为塑料对 抗体有吸附作用，用负20℃至负40℃低温冰箱冷冻， 由于冻融也会使抗体效价降低。而即用型抗体保存 时间一般在一年以内。用PBS稀释的抗体，一般可 放臵1个月，稀释比越低，效价降低越快。
一、固定液使用不当，破坏了组织的抗原
二、组织经固定和包埋后抗原被破坏。
三、烤片温度过高或时间过长。
一、抗原修复方式不正确或遗漏，或者是修复
时间、温度、修复液的PH值没有达到要求。 二、过氧化物酶阻断试剂阻断或血清封闭时间 过长，试剂浓度不合适。 三、一抗，二抗检测系统、显色试剂浓度过高、 过低或孵育时间过短。 四、使用已超过有效期的试剂。 五、孵育温度过低。 六、滴加试剂时，组织上的缓冲液（或血清） 残留过多，导致试剂滴加后被稀释。
从理论上说一种抗体只能与其相应的抗原起免
疫反应，单经过长时间实验以后，发现很多组 织都有“例外”的表达，目前大多用细胞的分 化不同阶段其抗原性有相应的变更来解释，可 能还有很多我们目前不知的原因，这种情况我 们就没办法解决了。
这种非特异性显色通常发生在高代谢器官组织
中，当组织切片进行抗原修复后，组织中所含 的内源性生物素同生物素二抗检测系统中的链 霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶发生链接二造成非 特异性显色，显色多位于胞浆中，且迷惑性极 大。
这种显色通常发生在红细胞，坏死组织，炎症
细胞中，是由于组织中所含的过氧化物没有用 相应的阻断试剂阻断或阻断不完全。
白发生交叉反应。
现象：阳性细胞和阴性细胞都着色，只 是阳性细胞着色略强一些。像这类情况 很难有好的办法解决，可找一个背景着 色较浅的试剂盒试一下，或用其它修复 方法试试。
一、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织
突起，实验过程中滴加试剂后不易冲洗干净， 导致染色过深。 二、用于裱片的水浴锅中的水质被细菌或酵母 菌等污染。 三、制作涂胶玻片时，浓度过高，干燥后在玻 片留下白色小点，显色时白色小点着色。 色原颗粒未完全溶解。