免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC）
定义：
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本
1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；
2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤
①石蜡切片制作
1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，
70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h
3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45 min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5 h或侵蜡过夜，用石蜡（Ⅲ）包埋组织。
5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7 μm厚度的组织切片。
6、贴片：将组织石蜡切片放在在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2-4 h
②免疫组织化学染色（SP三步法）
1、脱蜡
取出烘烤后保存的石蜡切片，室温放置30 min，然后分别在二甲苯I、II、III中浸泡各10 min。
2、复水
无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各5 min→95%乙醇溶液5 min→80%乙醇溶液5 min→70%乙醇溶液5 min→50%乙醇溶液5 min→ddH2O 5 min。
3、PBS冲洗2-3次，每次5min
4、灭活
3% H2O2溶液孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性
5、PBS冲洗2-3次，每次5min
6、抗原修复
将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温
7、PBS冲洗2-3次，每次5min
8、封闭
滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体；
9、滴加Ⅰ抗50 μl，室温静置1 h，或者37℃ 1 h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）；
10、PBS冲洗2-3次，每次5min；
11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50 μl，室温静置1 h，或371
℃ h；
12、PBS冲洗2-3次，每次5 min；
13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30 min-1h；
14、PBS冲洗2-3次，每次5 min；
15、显色：DAB显色5-10 min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）
（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）
（A：DAB B：H2O2C：磷酸缓冲液）
16、自来水冲洗10分钟终止反应
17、复染：苏木精复染2 min，盐酸酒精分化
18、自来水冲洗10-15min
19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检
③结果分析
每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。
免疫组化常用试剂及设备：
1、PBS：0.01 M磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)
2、固定液：4% 多聚甲醛溶液 (pH 7.4)
3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%
4、二甲苯
5、包埋剂：石蜡
6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）
7、抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0），或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）
8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）
试剂A --阻断剂：3%甲醇-H2O2溶液（30% H2O2和80%甲醇溶液配制）
试剂B --封闭液：正常非免疫动物血清
试剂C --二抗（辣根过氧化物酶标记）
试剂D --SP（链霉亲和素-过氧化物酶）
9、一抗（特异结合底物）
10、显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液
11、封固液：中性树胶，或50%缓冲甘油，或液体石蜡等
12、恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统
常用固定液
1、醛类固定剂：作用是使组织之间相互交联，将抗原保存在原位。
（1）3%中性甲醛固定液液：30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml
（2）4%多聚甲醛缓冲液：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml，加热搅拌（注意不要沸腾）至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS，使总容量为1000ml
（3）戊二醛－多聚甲醛缓冲液：在上述溶液中加入1％的戊二醛
（4）Bouin液：40％甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.
（5）PLP液(过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛固定液)
2、丙酮及醇类固定剂：原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀
（1）AAA液：纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml
（2）Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰冻切片的后固定
（3）Carnoy液：纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存
（4）丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定，用前在4℃冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5～10min
3、其他固定剂
（1）Zenker液：适合免疫球蛋白抗原的检测
（2）四氯化锇液：是电镜研究中所必需的固定液
抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片，原因：
a.福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭；
b. 甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
①抗原热修复
（1）高压热修复：
在沸水中加入0.5 mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0）或0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复：
电炉或者水浴锅加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波热修复：
在微波炉里加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
②酶消化法：
常用0.1%胰蛋白酶、0.4%胃蛋白酶液、皂素（Saponin）。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
免疫组织化学及其应用
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
实验动物组织切片免疫组织化学染色方法
ICS65.020.30 B44 中国实验动物学会团体标准 T/CALAS x-201x 实验动物组织切片免疫组织化学染色 方法 Laboratory animals-Immunohistochemical procedures for paraffin embedded tissues （征求意见稿） 201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布
前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。 本标准由中国实验动物学会归口。 本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本标准主要起草单位：浙江大学动物科学学院、浙江省医学科学院。 本标准主要起草人：吴旧生、刘月环。
实验动物组织切片免疫组织化学染色方法 1范围 本标准规定了实验动物组织切片的免疫组织化学染色方法。 本标准适用于实验动物组织切片的免疫组织化学检测。 2术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 2.1 免疫组织化学immunohistochemistry,IHC 用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位，对靶抗原进行定性、定位和定量的方法。 2.2 抗原antigen,Ag 一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。 2.3 抗体antibody 机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B 淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体。 2.4 抗原修复antigen repair 利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程。 3主要试剂 3.10.01M 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS） 先配成A 液和B 液，其中A：0.2M Na H 2PO 4贮存液（PH7.6）：15.60g 磷酸二氢钠 （NaH 2PO 4﹒2H 2O）溶解于少量水，加蒸馏水定容至500ml，放于4℃冰箱保存。B：0.2M Na 2HPO 4贮存液(HP7.6)：将35.82g 磷酸氢二钠（Na 2HPO 4﹒12H 2O）溶解并定容至500ml，贮存于4℃
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！ 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书
HE染色与免疫组织化学染色实验报告
华中农业大学动物科技动物医学院 HE染色与免疫组织化学染色实验报告 1实验目的及意义 1.1了解石蜡切片的制作过程 1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法 1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识 2 实验方法及步骤 2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤 2.1.1取材与固定： 从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。 2.1.2脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。 2.1.3浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。 2.1.4切片前的准备工作： 先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。 2.1.5切片与贴片： 将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。2.1.6 脱蜡至水
华中农业大学动物科技动物医学院 二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.7染色： 苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.8脱水和透明： 95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.9封固： 将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37℃烘箱。 2.2 SABC 染色步骤 2.2.1脱蜡至水： 二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ15分钟，100％酒精2分钟，95％酒精2分钟，80％酒精2分钟，70％酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.2.2流水冲洗5分钟（水流要小） 2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。 2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。 2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01M枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。 2.2.6取出切片放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。 2.2.7取出切片放入湿盒中，滴加5%BSA封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。 2.2.8甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加PBS,放入4℃冰箱过夜。 2.2.9放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。 2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。 2.2.11取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC） 定义： 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 免疫组化原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫组化检测标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片； 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。 免疫组化操作步骤 ①石蜡切片制作 1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。 2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，
免疫组织化学(荧光)方法及问题详解
目录： 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1) 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2) 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价 (4) 5.免疫组织化学对照实验 (5) 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除 (9) 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11) 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12) 15.双重免疫荧光标记法 (13) 16.免疫荧光组织化学直接法 (13) 17.免疫荧光组织化学间接法 (14)
1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料，如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。 (2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。 (4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素 类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。 (6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶(PＡP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶(ＡBC)法和链霉亲和素—过氧化物酶(ＳP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAＰ复合物（含３个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、ＰＡ Ｐ复合物孵育标本,最后用H ２Ｏ ２ 和二氨基联苯（DAB)为底物显示过氧 化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合４分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAＢ进行显色。AＢＣ法的敏感性较ＰAＰ法更高。
图１. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP法与ABC法相似，其不同于ＡBＣ法之处在于用生 物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在 标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化 物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入ＤAＢ进行显 色。与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相似而 非特异性结合较亲和素低。SＰ法简化了操作步骤，同时 也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥 化染色技术。 图2. SP法原理示意图二、实验准备： 1．标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片:由病理室常规处理 ③细胞爬片:将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞，待细胞生长达到6 ０％以上后取出玻片,4%多聚甲醛固定2 h。 2.试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后 将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体
免疫组织化学及HE染色实验步骤教学文案
免疫组织化学及H E 染色实验步骤
精品资料 免疫组织化学（ immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片 （1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月； （2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡 30min； （3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜； （4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块； （5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色 （1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min； （2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min； （3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min； （4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h； 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2
全自动免疫组织化学染色快速诊断【免疫组织化学的现状和应用】
全自动免疫组织化学染色快速诊断【免疫组织化学的现状和 应用】 【】R361 【】A 【】1672－3783(xx)08－0497－02 【摘要】：本文对免疫组化的优点作了简要介绍，同时介绍了其在病理诊断中的应用，有支持、鉴别诊断的作用，检测激素受体与生长因子，对预后及治疗产生重要意义。文中还叙说了免疫组化的结果对肿瘤细胞增生和分期具有评价作用，并对免疫组化应该注意的事项也逐一列举。 当免疫学的理论和技术进一步成熟发展后，就产生了免疫组织化学技术，将这一方法应用在病理诊断上就称为诊断免疫组织化学。在现代医学基础和临床研究中免疫组织化学对疾病尤其是对肿瘤的 诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。 （一）免疫组化的优点 （1）特异性强 免疫组化是利用抗原、抗体可以特异性结合，也就是“一对一”的结合的原理。 （2）敏感性高
现在免疫组化的ABC法、SP法的问世，抗体可以稀释成千上万倍甚至上亿倍，仍可发生抗原抗体的结合。 （3）定位精确 免疫组化的反应可在组织和细胞中进行，抗原实现了准确的定位观察，对于病理学的诊断和研究具有非常重要的意义。 （二）免疫组织化学的应用 （1）免疫组化对病理诊断具有支持和鉴别诊断的作用。 在病理诊断比较明确的情况下，应用组化标记可以起到支持诊断的作用。有时无法判断肿瘤时，组化的应用将起到极大的帮助，可以鉴别肿瘤的和性质。 （2）激素受体与生长因子的检测对预后及治疗具有十分重要的意义 激素受体的检测对于乳腺癌的研究已有了较明确的结论，雌激素受体阳性的乳腺癌患者预后优于阴性表达者，同时阳性表达者对内分泌治疗效果好，患者生存期延长。
免疫组化染色操作顺序
免疫组化染色操作顺序文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子）， 染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底 物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法 ( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行) 1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。 2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。 3.无水酒精Ⅰ30秒。 4.无水酒精Ⅱ30秒。 5.95%酒精Ⅰ30秒。 6.95%酒精Ⅱ30秒。 7.90%酒精30秒。 8.80%酒精30秒。 9.70%酒精30秒。 10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10) 11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 12.水洗。 13.抗原修复。 14.PBS洗3次，1分钟/次。 15.加入血清孵育20分钟。 16.摔干血清，加入一抗60分钟。 17.PBS洗3次，2分钟/次。 18加入二抗孵育30分钟。 19.PBS洗3次，2分钟/次。 20.加入ABC复合物，孵育30分钟。 21.PBS洗3次，2分钟/次。 22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。 23.PBS洗，水洗。 24.Harris苏木素染核5-10分钟。 25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，1分钟/次。 6.加入血清孵育10分钟。 7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入SP复合物孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗，水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (三)真空负压LSAB法 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min. 3.水洗。 4.如果需要，可进行抗原修复。 5.PBS洗3次，每次1分钟。 6.加入正常血清真空负压处理5min。 7.摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。 9.加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。 10.PBS洗3次，每次2分钟。 11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理5分钟。 12.PBS洗3次，每次2分钟。 13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 14.PBS洗，水洗。
第十三章免疫组织化学技术
第十三章免疫组织化学技术 第一部分目的要求和教学内容 目的要求：掌握金免疫测定的方法，免疫金银染色的原理、方法，熟悉胶体金和免疫金的特性和制备。 一、免疫胶体金标记原理。 二、免疫胶体金的制备原则：标记要点和影响因素，胶体金标记蛋白的纯化和鉴 定。 三、免疫金（银）染色法：滤纸模型的免疫金（银）染色应用，免疫金（银） 染色技术类型，组织切片的免疫金（银）染色法。 第二部分测试题 一、选择题 （一）A1 型题(标准型) 1 .PAP复合物中的酶是 A.碱性磷酸酶 B.葡萄糖氧化酶 C.辣根过氧化物酶 D.胃蛋白酶 E.胶原酶 2.PAP的特点是几个抗酶抗体和3 个过氧化物酶分子组成复合物，结构非常稳定 A.1 B.2 C.3 D.4 E.6 3.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.链霉素亲和素 4.双标记荧光免疫法中，如用罗丹明标记A 抗体，呈什么颜色，用异硫氰酸荧光素标记B 抗体，呈什么颜色 A.黄绿色，橘红色 B.橘红色，黄绿色 C.红色，淡黄色 D.淡黄色，红色 E.橙黄色，浅绿色 5. 荧光免疫间接法比直接法荧光增强多少倍，敏感性提高多少倍
A.1—2 B.2—4 C.3—6 D.4—8 E.5—10 6. 胶体金标记蛋白时，待标记蛋白的实际用量是在稳定1ml 胶体金所需蛋白基础上再增加多少 A. 5—10% B. 10—20% C. 20—30% D. 30—40% E. 40—50% 7.铁蛋白是一种含铁多少，相对分子量为650～900KD 的球形蛋白 A.15% B.20% C.25% D.30% E.35% 8.下列哪种方法制备的胶体金是红色 A.枸橼酸三钠 B.白磷 C.维生素C D.乙醇-超声波 E.硼酸钠 9.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理 B.抗体的处理与保存 C.设立对照试验 D.结果判断 E.免疫染色 10.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.标记物 C.固定剂 D.抗体 E.洗涤液 二、填空题 1.用丙酮做固定剂的抗原是（）；用1%聚甲醛做固定剂的抗原是（）；用10%甲 醛做固定剂的抗原是（）；用95%乙醇做固定剂的抗原是（）；用四氯化磺做固 定剂的抗原是（）。 2.免疫染色对特殊标本的进一步处理常用（）和（）法。 3.免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是（）、（）和
免疫组化的原理和步骤
免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验所用的有哪些？ 免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体交叉反应的原因： 指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面： 1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。 2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。 3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。 免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述 *免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC) -是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、
全组织免疫组织化学染色
全组织免疫组织化学染色指南 全组织免疫组织化学染色指南和疑难解析： ●全组织染色尤其是胚胎，是指组织并没有切片，而是组织的一小块进行的整体 染色方法。胚胎干细胞、胚胎发育学研究者以及神经学者通过动物的不同发育阶段表达不同的目的蛋白这一特点而对不同阶段的动物全胚胎进行染色。 ●全组织染色与免疫细胞化学以及冰冻切片染色十分类似。如果一种抗体可以应 用于冰冻切片（并不包括石蜡包埋的切片）染色中的话，那么在全胚胎染色中也是适用的。 ●不同之处在于全胚胎染色的样品比正常的切片样品更大更厚。因此，固定、封 闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。虽然研究者们使用不一样的次数，但必要的话这些步骤中的细节对于优化实验也可以提供指导。 一、固定中很重要的一点： 使用同一种抗体时，在冰冻切片中成功使用的固定液，一般都适合用来做全组织染色的。然而，大多数研究人员偏好于使用4%多聚甲醛。 虽然4%多聚甲醛的这个浓度是很低的，但这还是需要整个样品等待长时间以使得溶液可以渗透到样品的中心。因此，这并不适合所有的抗体，这是由于4%多聚甲醛固定液引起的蛋白交联会使很多抗体不能识别其抗原表位。 一般，石蜡切片需要进行抗原修复。而由于抗原修复中的加热步骤会损坏胚胎样品，故胚胎样品不需要加热修复抗原这一步骤。如果多聚甲醛固定在组织整体固定中不可行的话，这就可能是因为抗体对于蛋白交联比较敏感，那么就需要选择其他的固定液。甲醇是人们在组织整体免疫染色步骤中固定液的第二种常用选择。 斑马鱼胚胎的固定和准备需要额外的步骤以确保卵膜被彻底渗透。 二、获取图像： 观看全胚胎图像可以使其在爬片之前漂浮在一个盛有甘油溶液的培养皿中观察。如果胚胎很小的话，可以使用甘油爬片后，盖盖玻片之前进行观察。 在这种情况下，可以在盖玻片周围滴加油脂，使其不易移动且可以减少使用显微镜观察时造成的盖玻片的损坏。然而，如果通过全胚胎很难观察一个清晰的染色图像的话，也可以使用明胶对全胚胎进行分开后观察，这种情况尤其适用于大的后期胚胎阶段和大的组织样品。 如果使用免疫荧光标记的话，共聚焦显微镜是很好的观察全胚胎的工具。这样就不用在染色后又将全胚胎分成几个玻片进行观察了。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学（ immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片 （1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月； （2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡30min； （3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜； （4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块； （5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色 （1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min； （2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min； （3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min； （4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h； （5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；
免疫组化抗体选择及常用染色方法
免疫组化抗体选择及常用染色方法 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 二、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书