免疫组织化学染色技术 PPT课件
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免疫组化 ppt课件
荧光显微镜或电子显微镜观察。
抗体的标记
为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记， 利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大， 并转换成可见的荧光或呈现出颜色。
免疫组化常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（FITC）呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200） -橙红色荧光。
1.取材：从动物或者患者取下组织材料。 2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝 固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。 3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用 梯度酒精进行脱水。（自动脱水机） 4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋， 将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之 凝固成蜡块。（包埋机） 5.切片与贴片：（ 组织切片机） （1）切片 （2）展片 （3）贴片
② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。 ③ 生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
染色方法
1.直接法
用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原 结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；
2.间接法
免疫组化染色（石蜡切片）
1.烤片 65℃ 1-2h 2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化 3.灭活内源性过氧化物酶 4.抗原修复 5.封闭 6.一抗过夜 7.加入有标记的二抗 8.显色 9.苏木素复染 10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。
免疫组化应用
➢在临床上的应用 ➢在科研中的应用
在临床上的应用：
荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
3.非标记Ab桥法
免疫组织化学染色SP技术课件
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
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S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
武汉大学病理教研室
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
（迈新）；或60℃过夜
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
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S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
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具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
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染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
（迈新）；或60℃过夜
免疫组化PPT课件
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未封闭内源性过氧化物酶
29
30
胃固有膜腺体
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3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
32
五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
58
59
60
61
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63
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抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
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未封闭内源性过氧化物酶
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胃固有膜腺体
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3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
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五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
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Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
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抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
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免疫组织化学染色技术PPT课件
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
免疫组织化学技术ppt课件
谢 请多
谢！ 指教！
异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致
抗体与组织产生非特异性结合； （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸
酶及生物素等产生非特异性显色；
免疫组化操作经验和体会
• 操作中应注意以下问题：
1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。 2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS洗涤要充分。 4.要设阴性和阳性对照。 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。
• 5.复合型 在常规免疫组化标记中，同一
种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞 核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现 胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组 织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺 ER和PR修复不充分也可以发生胞核和胞 浆同时阳性。
三、阳性标记组织学特征
• 根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，
五、非特异着色特征
• 以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断：
（1）抗体交叉反应： 是由于该抗原决定簇同时 存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星 形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严 重，可表达于多种组织细胞。因此，应全面了解 和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反 应只要应用得当仍有助于诊断。
• 近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学
的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病， 尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研 究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物 的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异， 而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。 故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在 光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化 技术，审慎判断其标记的意义。
2-1 免疫组织化学技术PPT课件
能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗 原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类 脂都属于半抗原。
免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节 免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合 素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧 基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5； 在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与 生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子 存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果 若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核， 水溶性封片剂封片。
免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节 免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合 素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧 基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5； 在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与 生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子 存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果 若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核， 水溶性封片剂封片。
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
21
PAP法的原理
PTP课件
22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
PTP课件
4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
PTP课件
5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组化及特殊染色ppt课件
免疫组化及特殊染色
6
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
免疫组化及特殊染色
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IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
免疫组化及特殊染色
5
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
免疫组化及特殊染色
3
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
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酶---免疫酶法 荧光染料---免疫荧光法 铁蛋白---免疫铁蛋白法 胶体金---免疫金银法 放射性同位素----放射免疫法
根据染色步骤
直接法：例-免疫荧光探针
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原 物质。 例：两步法，三步法及多步法 优点：提高灵敏度，同时避免多次标记I抗
第二节 免疫组织化学的关键技术
第三节 酶免疫组织化学染色
第四节 荧光免疫组织化学技术
第五节 免疫金银法
本
免疫组化的概念及原理 （重点掌
次 课
第一节 概述
握）
免疫组化分类（了解）
程
常用免疫组化方法（熟悉）
任
免疫组化特点（熟悉）
务
第二节 免疫组织化学的关键技术（学习难点）
第三节 酶免疫组织化学染色
【教学目的与要求】
Elisa试验）
❖将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测 （蛋白印记）---免疫印记技术（Westernblot）
主讲人：王兴名
指导教师：王洪江
在此特别感谢我的导师王洪江老师及研究生科三位老师的指导与支持！谢谢。
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
在
、血型抗原
异嗜性抗原：人与其他动物、植 物等之间存在的共同抗原
（2）抗体（antibody）
❖机体受抗原刺激后由B淋巴细胞,特别是浆 细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特 异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。
Illustration of EnVision method
Secondary antibody
Primary antibody
Ag Ag
Enzyme, AP or HRP
小复习：
显色剂
酶标II抗
特异性I抗
组织内抗原
※ 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）
❖用于鉴别肿瘤的组织来源 ❖细胞受体检测 ❖病毒性抗原检测 ❖癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测 ❖重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制
P-O
Avidin-biotin-peroxidase complex
Avidin P-O HRP
sp法
基本原理与ABC法相似，但与ABC法稍有不同： 是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混 合液来测定细胞和组织中的抗原
Illustration of SP method
❖特性：能够与相关抗原特异性结合。
（3）酶促反应：II抗用酶标记（如辣根过氧 化物酶等），与底物发生酶促反应。
酶促反应的特点：高效性 特异性 操作简单 条件可控。
❖总结： （1）+（2）+（3）==免疫组织化学的优点：
2.免疫组化染色原理：
免疫反应+组织化学 结合的产物 1.利用了免疫学基本原理：抗
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
ABC试剂盒
1 .封闭用血清 2.生物素标记II抗 3.A试剂： 卵白素（抗生物素） 4.B试剂：生物素-过氧化物酶复合物
Illustration of ABC method P-O
Biotinylated second antibody
P-O
Primary antibody
Antigen
Biotin
2.特点：荧光显微镜 下观察
免疫酶标方法
1.目前应用最为广 泛
2.原理：抗原抗体 反应，酶标记抗 体，加底物显色
3.特色：准、清、 久、兼容。
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
水化、洗涤：PBS浸泡 5min
5.灭活
3%H2O2溶液，室温10min，以消除内源性过氧化 物酶的活性
6.抗原修复
❖ 目的：暴露抗原,提高通透性,增强特异性染色 ❖ 方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，PH=6.0 , 0.01M ❖ 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。 ❖ PBS洗涤 3次
图例
直接法：特异性 间接法:灵敏性
一步法
三步法、两步法
根据结合方式：
抗原-抗体结合：例如过氧化物酶-过 氧化物酶复合物法
亲和连接法：ABC法 S-P法
三、较常用的免疫组织化学方法
❖免疫荧光法 ❖免疫酶标方法 ❖免疫胶体金技术
免疫荧光法
1.原理：抗原抗体特 异性结合 用荧光素标 记I抗进行反应。
1.原位性 2.显色反应 3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强 6.敏感性高
1.原位性 原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆
细胞器层面
2.显色反应
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
3.形态、代谢和功能三结合 形态—显色反应 代谢、功能—抗原含量及位置
综合两门技术，并借助显微镜检测各种物质。
本质：组织化学染色+原位示踪技术
发展历程：免疫荧光法---酶标抗体技术—酶抗酶复 合物技术—胶体金标记技术以及亲和标记技术--出现原位杂交技术及PCR技术。
（二）免疫组织化学原理（重点掌握）
1.（回顾）理论基础： （1）抗原（antigen）
是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生 抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴 细胞在体内或体外特异性结合的物质。
最后一步：结果判读
❖结果判读要考虑以下几个方面 ❖ A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，
细胞间质 ❖ B、阳性细胞数 ❖ C、染色强度
光学显微镜下结果判断判读举例：
食管鳞状细胞癌 CD44蛋白强阳 性表达，表达位置：细胞质
乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表 达
在有转移的HCC中，VEGF呈 强阳性表达 ABC ×200
化作用，从而保护蛋白质免受破坏）
2.组织包埋
目的：使组织保持一定的形状和硬度, 易于切片 方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等
3.制片
切片： 4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附 于载玻片。
烤片： 70℃ 2h，目的---充分贴附
4.脱蜡
脱蜡：二甲苯溶液， 6min*5次，再用乙醇洗掉二 甲苯
10.滴加底物
采用的方法不同，底物有一定差异.
后面详细分析
11.滴加显色剂
11、滴加显色剂： ❖如DAB ，室温，5min左右。 ❖注意：光镜下掌握染色时间； ❖流水冲洗 5min
12.复染
苏木素复染（细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化
13.“成片”
流水充分冲洗 梯度酒精脱水 中性树胶固定，封片，晾干后镜检。
肠镜检查在横结肠发现12mm的病灶，活检证实为 腺癌。（ CK7和CK20联合应用）
免疫组化：协助临床诊断！
某些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗
作用靶点 肿瘤类型
Tratugumab(赫赛 HER2 汀）
乳腺癌和胃癌
Cetuximab（艾 EGFR 比妥）
结肠癌，非腺癌
Bevacizumab（ VEGF 阿瓦斯汀）
制作 内容
医学免疫学
Company
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第27章 免疫组织化学技术
主讲教师：王兴名
指导教师：王洪江老师
2014-04-15
实例
35岁女性，左颈淋巴结肿大，CT扫 描未发现原发灶？临床如何处理？
活检：提示为腺癌（转移性）
行免疫组化染色：肿瘤细胞CK7（-）， CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠 来源。
原与抗体结合的高度特异性 2.借助化学显色方法
具体的反应原理?
提取靶蛋白（作为抗原）
获得鼠I抗
实验 动物
标标记记性性II抗I抗
DAB
酶或生物素
显色
获得II抗
二、免疫组织化学分类
根据标记抗体种类不同
根据染色步骤分类
根据结合方式：抗原抗体结合： 如：过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP法） 亲和连接
根据标记抗体不同：
+
–
– (但常会黏液腺癌 + 阳性表达)
– (但黏液型可以阳 + 性)
❖EBV ❖HPV ❖HBsAg 和HBCAg ❖MCV
病原体的标记
※举一反三 融会贯通（了解）
小拓展--免疫组织化学（酶联免疫组织化学） 的延伸：
❖荧光标记---荧光标记免疫组织化学 ❖血清中抗原检测---酶联免疫吸附试验（
7.血清封闭
封闭后勿洗涤！
目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源 性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）
方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清
8.特异I抗孵育
适当比例稀释I抗，37℃孵育1h或4℃冰箱过夜。 ❖PBS洗涤 2min*3次
9.II抗孵育
滴加生物素化II抗工作液50-100ul室温孵育 20分钟，PBS洗涤2min*3次
4.定性、定量及定位三位一体
存在吗？ 在哪里？ 有多少？
根据染色步骤
直接法：例-免疫荧光探针
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原 物质。 例：两步法，三步法及多步法 优点：提高灵敏度，同时避免多次标记I抗
第二节 免疫组织化学的关键技术
第三节 酶免疫组织化学染色
第四节 荧光免疫组织化学技术
第五节 免疫金银法
本
免疫组化的概念及原理 （重点掌
次 课
第一节 概述
握）
免疫组化分类（了解）
程
常用免疫组化方法（熟悉）
任
免疫组化特点（熟悉）
务
第二节 免疫组织化学的关键技术（学习难点）
第三节 酶免疫组织化学染色
【教学目的与要求】
Elisa试验）
❖将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测 （蛋白印记）---免疫印记技术（Westernblot）
主讲人：王兴名
指导教师：王洪江
在此特别感谢我的导师王洪江老师及研究生科三位老师的指导与支持！谢谢。
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
在
、血型抗原
异嗜性抗原：人与其他动物、植 物等之间存在的共同抗原
（2）抗体（antibody）
❖机体受抗原刺激后由B淋巴细胞,特别是浆 细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特 异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。
Illustration of EnVision method
Secondary antibody
Primary antibody
Ag Ag
Enzyme, AP or HRP
小复习：
显色剂
酶标II抗
特异性I抗
组织内抗原
※ 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）
❖用于鉴别肿瘤的组织来源 ❖细胞受体检测 ❖病毒性抗原检测 ❖癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测 ❖重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制
P-O
Avidin-biotin-peroxidase complex
Avidin P-O HRP
sp法
基本原理与ABC法相似，但与ABC法稍有不同： 是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混 合液来测定细胞和组织中的抗原
Illustration of SP method
❖特性：能够与相关抗原特异性结合。
（3）酶促反应：II抗用酶标记（如辣根过氧 化物酶等），与底物发生酶促反应。
酶促反应的特点：高效性 特异性 操作简单 条件可控。
❖总结： （1）+（2）+（3）==免疫组织化学的优点：
2.免疫组化染色原理：
免疫反应+组织化学 结合的产物 1.利用了免疫学基本原理：抗
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
ABC试剂盒
1 .封闭用血清 2.生物素标记II抗 3.A试剂： 卵白素（抗生物素） 4.B试剂：生物素-过氧化物酶复合物
Illustration of ABC method P-O
Biotinylated second antibody
P-O
Primary antibody
Antigen
Biotin
2.特点：荧光显微镜 下观察
免疫酶标方法
1.目前应用最为广 泛
2.原理：抗原抗体 反应，酶标记抗 体，加底物显色
3.特色：准、清、 久、兼容。
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
水化、洗涤：PBS浸泡 5min
5.灭活
3%H2O2溶液，室温10min，以消除内源性过氧化 物酶的活性
6.抗原修复
❖ 目的：暴露抗原,提高通透性,增强特异性染色 ❖ 方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，PH=6.0 , 0.01M ❖ 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。 ❖ PBS洗涤 3次
图例
直接法：特异性 间接法:灵敏性
一步法
三步法、两步法
根据结合方式：
抗原-抗体结合：例如过氧化物酶-过 氧化物酶复合物法
亲和连接法：ABC法 S-P法
三、较常用的免疫组织化学方法
❖免疫荧光法 ❖免疫酶标方法 ❖免疫胶体金技术
免疫荧光法
1.原理：抗原抗体特 异性结合 用荧光素标 记I抗进行反应。
1.原位性 2.显色反应 3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强 6.敏感性高
1.原位性 原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆
细胞器层面
2.显色反应
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
3.形态、代谢和功能三结合 形态—显色反应 代谢、功能—抗原含量及位置
综合两门技术，并借助显微镜检测各种物质。
本质：组织化学染色+原位示踪技术
发展历程：免疫荧光法---酶标抗体技术—酶抗酶复 合物技术—胶体金标记技术以及亲和标记技术--出现原位杂交技术及PCR技术。
（二）免疫组织化学原理（重点掌握）
1.（回顾）理论基础： （1）抗原（antigen）
是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生 抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴 细胞在体内或体外特异性结合的物质。
最后一步：结果判读
❖结果判读要考虑以下几个方面 ❖ A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，
细胞间质 ❖ B、阳性细胞数 ❖ C、染色强度
光学显微镜下结果判断判读举例：
食管鳞状细胞癌 CD44蛋白强阳 性表达，表达位置：细胞质
乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表 达
在有转移的HCC中，VEGF呈 强阳性表达 ABC ×200
化作用，从而保护蛋白质免受破坏）
2.组织包埋
目的：使组织保持一定的形状和硬度, 易于切片 方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等
3.制片
切片： 4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附 于载玻片。
烤片： 70℃ 2h，目的---充分贴附
4.脱蜡
脱蜡：二甲苯溶液， 6min*5次，再用乙醇洗掉二 甲苯
10.滴加底物
采用的方法不同，底物有一定差异.
后面详细分析
11.滴加显色剂
11、滴加显色剂： ❖如DAB ，室温，5min左右。 ❖注意：光镜下掌握染色时间； ❖流水冲洗 5min
12.复染
苏木素复染（细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化
13.“成片”
流水充分冲洗 梯度酒精脱水 中性树胶固定，封片，晾干后镜检。
肠镜检查在横结肠发现12mm的病灶，活检证实为 腺癌。（ CK7和CK20联合应用）
免疫组化：协助临床诊断！
某些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗
作用靶点 肿瘤类型
Tratugumab(赫赛 HER2 汀）
乳腺癌和胃癌
Cetuximab（艾 EGFR 比妥）
结肠癌，非腺癌
Bevacizumab（ VEGF 阿瓦斯汀）
制作 内容
医学免疫学
Company
LOGO
第27章 免疫组织化学技术
主讲教师：王兴名
指导教师：王洪江老师
2014-04-15
实例
35岁女性，左颈淋巴结肿大，CT扫 描未发现原发灶？临床如何处理？
活检：提示为腺癌（转移性）
行免疫组化染色：肿瘤细胞CK7（-）， CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠 来源。
原与抗体结合的高度特异性 2.借助化学显色方法
具体的反应原理?
提取靶蛋白（作为抗原）
获得鼠I抗
实验 动物
标标记记性性II抗I抗
DAB
酶或生物素
显色
获得II抗
二、免疫组织化学分类
根据标记抗体种类不同
根据染色步骤分类
根据结合方式：抗原抗体结合： 如：过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP法） 亲和连接
根据标记抗体不同：
+
–
– (但常会黏液腺癌 + 阳性表达)
– (但黏液型可以阳 + 性)
❖EBV ❖HPV ❖HBsAg 和HBCAg ❖MCV
病原体的标记
※举一反三 融会贯通（了解）
小拓展--免疫组织化学（酶联免疫组织化学） 的延伸：
❖荧光标记---荧光标记免疫组织化学 ❖血清中抗原检测---酶联免疫吸附试验（
7.血清封闭
封闭后勿洗涤！
目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源 性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）
方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清
8.特异I抗孵育
适当比例稀释I抗，37℃孵育1h或4℃冰箱过夜。 ❖PBS洗涤 2min*3次
9.II抗孵育
滴加生物素化II抗工作液50-100ul室温孵育 20分钟，PBS洗涤2min*3次
4.定性、定量及定位三位一体
存在吗？ 在哪里？ 有多少？