从组织器官分离细胞
原代细胞培养过程
原代细胞培养过程细胞是生命的基本单位，是构成生物体的基本组成部分。
细胞的研究对于生命科学的发展具有重要的意义。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的未经过传代的细胞，具有较高的生物学活性和生物学特性，是细胞学、生物学、医学等领域的重要研究对象。
原代细胞培养是将原代细胞在体外培养的过程，是细胞学研究的重要手段之一。
原代细胞培养的目的原代细胞培养的主要目的是为了研究细胞的生物学特性、生长和分化规律、细胞信号传导、细胞凋亡、细胞周期等方面的问题。
同时，原代细胞培养还可以用于药物筛选、毒性测试、细胞治疗等方面的研究。
原代细胞培养的步骤原代细胞培养的步骤主要包括细胞分离、细胞培养、细胞传代等。
1. 细胞分离细胞分离是将组织或器官中的细胞分离出来的过程。
常用的细胞分离方法有机械分离、酶消化、胶原酶消化等。
其中，酶消化是最常用的方法之一。
酶消化可以使细胞间的胶原纤维、基质等物质被消化，从而使细胞分离出来。
酶消化的时间和酶的浓度需要根据不同的组织和细胞类型进行调整。
2. 细胞培养细胞培养是将分离出来的细胞在体外培养的过程。
细胞培养需要提供适宜的培养基、培养条件和培养器具。
培养基是细胞培养的基础，包括营养物质、生长因子、激素等。
培养条件包括温度、湿度、氧气浓度、CO2浓度等。
培养器具包括培养皿、培养瓶、细胞培养箱等。
3. 细胞传代细胞传代是将原代细胞在体外培养的过程中，将细胞分离并继续培养的过程。
细胞传代的次数越多，细胞的生物学特性和生物学活性就越低。
因此，在进行原代细胞培养时，需要根据实验的需要和细胞的特性来确定细胞传代的次数。
原代细胞培养的注意事项1. 细胞分离时需要注意细胞的完整性和活性，避免对细胞造成损伤。
2. 细胞培养时需要注意培养基的配制和培养条件的控制，避免对细胞造成不良影响。
3. 细胞传代时需要注意细胞的生长状态和细胞的传代次数，避免对细胞造成不可逆的影响。
4. 细胞培养过程中需要注意细胞的无菌性和培养器具的消毒，避免细胞被细菌、真菌等微生物污染。
动物细胞原代培养名词解释
动物细胞原代培养名词解释1.引言1.1 概述动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，被广泛应用于生物学研究领域。
通过原代培养，科研人员可以将动物体内的细胞从组织或器官中分离出来，并在适当的培养条件下培养和繁殖这些细胞。
这种培养方法能够维持细胞的生长和功能，使其能够在体外环境下长期存活。
原代培养的过程可以分为两个主要阶段：细胞分离和细胞培养。
首先，需要将动物组织或器官进行机械或酶解分离，以获得单个的细胞悬浮液。
然后，将这些分离的细胞种植在含有适当培养基和营养物质的培养皿中，提供合适的温度、湿度和氧气条件，使细胞得以生长和分裂。
通过原代培养，科研人员可以获得大量的动物细胞来进行各种实验和研究。
这些细胞可以用于研究细胞的生理功能、细胞周期、细胞信号传导以及疾病模型的建立等。
此外，通过原代培养还可以进行细胞遗传学研究、药物筛选和细胞工程等领域的实验。
总而言之，动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，可以为科研人员提供源源不断的动物细胞来进行各种研究。
它为细胞生物学、医学研究以及药物开发等领域的进展提供了坚实的基础，并在解决许多科学问题中扮演着重要的角色。
文章结构指的是文章的组织框架和布局。
它的作用在于使读者能够清晰地理解整篇文章的内容和结构，从而更好地把握文章的主旨和论证思路。
本文按照以下结构进行组织和呈现：1. 引言1.1 概述在这一部分，将对动物细胞原代培养的基本概念和背景进行简要介绍，引起读者的兴趣，并提出研究的意义。
1.2 文章结构（即本节内容）在这一部分，将对整篇文章的结构进行概述，介绍各个章节的内容以及它们在整篇文章中的作用。
1.3 目的在这一部分，明确研究动物细胞原代培养的目的，说明研究的意义和价值，为读者提供清晰的导向。
2. 正文2.1 原代培养详细介绍什么是原代培养，原代培养的步骤和方法，以及原代培养在细胞研究中的重要性和应用领域。
2.2 动物细胞介绍动物细胞的结构和特点，包括细胞膜、细胞质、细胞核等重要组成部分，以及动物细胞在生物学研究和医学领域中的应用。
组织培养的作用
组织培养的作用
组织培养是一种利用细胞培养技术将组织、器官或细胞分离后，将其培养在含有营养物质的人工培养基中的技术。
其作用主要有以下几点：
1. 快速繁殖：运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，这可以对目标植物进行快速大量的繁殖。
2. 种苗脱毒：针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。
3. 远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。
4. 突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。
5. 基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。
6. 生物制品生产：有些极其贵的生物制品，如药物紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。
7. 疾病模型建立：通过组织培养技术，可以模拟疾病情况，从而帮助科研人员模拟疾病的发生和发展过程，为药物筛选和研究提供重要的参考。
8. 临床医学应用：在临床医学中，组织培养技术也发挥了重要作用，如为患者进行组织和器官移植，以及帮助研究病毒的
传播和感染机制等。
总体来说，组织培养技术在多个领域都有广泛的应用，为人类的生产和发展提供了重要的支持。
细胞系的建立和应用
细胞系的建立和应用细胞系是由同一个母细胞分裂而来、具有相同遗传信息的细胞族群。
其建立与应用已成为生物学和医学领域研究的基本工具。
细胞系的建立建立细胞系的方法主要有两种：一种是从组织块或器官中分离出单个细胞，再将其培养并分别扩增，形成单克隆细胞系；另一种是通过无胚胎发育的细胞融合技术，将不同来源的细胞融合在一起，并在特定培养条件下使其融合成为细胞群体，进而形成细胞系。
建立细胞系的过程需要多方面因素的考虑与控制。
首先，需要选择合适的培养基和培养条件，以提供细胞生长所需的营养物质、生长因子、激素、气体等要素。
其次，需要控制培养环境中的细菌、真菌等微生物的污染，以免干扰细胞生长和影响细胞得到的结果。
此外，还需要定期对细胞进行细胞分裂和重塑的处理，以保持细胞的形态和功能的稳定性。
细胞系的应用细胞系在研究分子遗传学、生理学、病理学和药理学等生命科学领域发挥着重要的作用。
在分子遗传学研究中，利用细胞系可以探究基因表达、细胞周期调控、突变、DNA复制、重组等多个分子遗传学过程，并进而研究与其相关的遗传疾病与生命过程。
在病理学研究中，利用细胞系可以建立一系列人类疾病细胞系，如人类肾脏细胞系、肝细胞系、乳腺癌细胞系等，进而研究肿瘤细胞的生物学特征、治疗方法等，并有望将细胞系用于新药药效评估和毒理学研究等领域。
在药理学研究中，细胞系也扮演着重要角色。
将人体细胞载入培养基内，观察药物对细胞行为的影响，可以预测在人体内的反应情况，快速筛选出多个候选药物，进而进行临床前研究。
细胞系的研究成果还可应用于基础研究和应用技术开发等领域，如细胞工程、组织工程及再生医学技术等。
尽管细胞系最初的建立和应用只关注少量的细胞，但是在日益发展的生物科技中，细胞系已经成为了广泛应用的技术手段之一。
细胞系的建立和应用，不仅加速了我们对生命体系的认识和理解，更有望为人类健康和生命科学的研究提供无限可能。
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
细胞培养技术的实验原理是
细胞培养技术的实验原理是
细胞培养技术的实验原理是通过提供适宜的培养基、温度、湿度和气氛等条件，将细胞从体内或体外分离出来，然后在无菌环境下培养和繁殖。
细胞培养可以分为原代培养和细胞系培养两种。
原代培养是从体内获取原发细胞，并将其传代培养。
首先，需要从组织或器官中获得细胞，通常通过消化和分散组织，使用酶来降解细胞间的黏连物质，并加入一种细胞培养基，提供细胞所需的氨基酸、维生素、糖类、盐类等营养物质。
培养基中的血清可以提供生长因子、激素等促进细胞生长的成分。
随着时间的推移，细胞会逐渐分裂和繁殖，形成细胞群体。
细胞系培养是从原代细胞中筛选出生长良好的细胞，然后进行传代培养。
传代培养时，细胞需要周期性地移至新的培养器皿中，并提供新的培养基。
细胞系培养的培养基中通常会去除血清，换成类似血清的添加物，例如人血清蛋白或胎牛血清蛋白，以减少细胞培养中传递的疾病风险。
细胞培养的实验原理是为了研究细胞的生物学特性、生长过程、分化、代谢、免疫特征等。
通过细胞培养，可以更好地理解细胞的功能和基本机制，以及开发新的药物和治疗方法。
此外，细胞培养也可用作细胞工程和组织工程的基础，用于器官和组织的再生和修复。
细胞生物学中的细胞分离和培养技术
细胞生物学中的细胞分离和培养技术细胞分离和培养技术在细胞生物学领域中起着至关重要的作用。
通过这些技术，科学家们能够分离出人体或其他生物体中的不同类型的细胞，并将其培养在适当的培养基中，使其继续生长和繁殖。
这些技术为我们研究细胞的功能和特性提供了重要的工具。
本文将详细介绍细胞分离和培养技术的原理、方法和应用。
一、细胞分离技术细胞分离是指将复杂的组织和器官中的细胞分离出来，以获得纯净的细胞群。
常用的细胞分离技术包括机械法、酶消化法和负选择法等。
1. 机械法机械法是最简单也是最常用的细胞分离方法之一。
它利用机械力对组织进行研磨或切割，使组织细胞变成悬浮状态。
通过滤网或离心等方法，能够分离出不同大小、形态和密度的细胞。
2. 酶消化法酶消化法是利用特定的酶对组织进行消化，以破坏组织细胞之间的黏着力，并分离出单个的细胞。
常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶和牛血清蛋白酶等。
3. 负选择法负选择法是通过标记已知种类的细胞，并将其排斥在分离细胞群之外，从而获得目标细胞。
这种方法可以用于从复杂的细胞混合物中分离出特定的细胞类型。
二、细胞培养技术细胞培养技术是将分离出的细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的温度、湿度和营养条件，使细胞能够在体外继续生长、增殖和分化。
细胞培养技术广泛应用于医学研究、药物筛选和生物工程等领域。
1. 组织培养组织培养是将整个组织或组织片段放置在培养皿中，并提供适当的培养基，使组织细胞能够在体外长时间存活。
通过组织培养，可以研究组织的生长、分化和再生能力。
2. 原代细胞培养原代细胞培养是将从动物体内直接分离得到的细胞进行培养。
这些细胞最接近原始状态，具有更大的培养和繁殖能力。
原代细胞培养广泛应用于研究和生产中。
3. 细胞系细胞系是指从原代细胞培养中得到的无限增殖能力的细胞。
细胞系广泛应用于药物筛选、疫苗生产、毒性测试等领域。
常见的细胞系有HeLa细胞、293细胞和NIH/3T3细胞等。
三、细胞培养技术的应用细胞培养技术在许多领域都有重要的应用。
原代细胞培养酶消化法
原代细胞培养酶消化法原代细胞培养是指从组织或器官中分离出来的一次性细胞，而不是从已经分离出来的细胞线进行培养。
在实验室中，原代细胞培养是一项重要的技术，可以用于许多生物医学研究的领域。
原代细胞培养酶消化法是一种利用酶进行细胞的分离和培养的方法。
下面将从步骤、特点、注意事项三个层面来介绍原代细胞培养酶消化法。
一、步骤1. 细胞的分离和取样选择样品后，先用温暖的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样品，去除血液和杂质，然后将组织切成小块。
可选择合适的工具进行，比如利器、组织分离剂、机械搅拌、离心等。
注意切割时要干净、快速，避免氧化、变质。
然后将分离的组织块放在消化酶中，浸泡时间根据组织不同而有所不同，一般为30-60分钟。
2. 细胞的过滤和沉淀为了防止组织块在培养灌流系统中堵塞，需要用网筛或过滤纱布过滤，去除固态组织块，得到单个的细胞。
过滤后，可用离心仪或站立离心管离心，使组织细胞沉淀到培养底物上，需要注意碎片和杂质清理干净，否则容易影响细胞生长。
3. 培养液的添加和培养条件的调节将细胞块放入消化液中，待单个细胞离体后离心沉淀，用PBS进行洗涤，将细胞在含血清控制的培养基中进行细胞培养。
在培养的过程中要注意细胞的黏附，可在内壁涂覆一层明胶质量。
温度也是一个非常重要的因素，应维持在36-37°C，CO2含量建议为5-10％。
4. 细胞的鉴定和分化可通过视觉或细胞染色等方法鉴定细胞的纯度和活性，晶体紫和格林盏染色法非常常用。
也可尝试不加血清的培养方法，探究不加血清对细胞生长和分化所产生的影响。
需要注意的是，在细胞分化的过程中要防止细胞的聚集和过多的细胞死亡。
二、特点1. 可以获取真正的原生细胞，避免不同细胞互相干扰的情况发生。
2. 让细胞在一个天然环境中良好的生长，适合生物医学研究领域的多个应用方向。
3. 原代细胞培养在研究中的可重复性更高，结果也更可靠。
三、注意事项1. 在取样和分离细胞的过程中，需要降低不必要的交叉污染。
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从组织器官分离细胞
一、非酶分离细胞方法
(一)机械分离法适用于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织、肿瘤组织等。
1.组织研磨法：
操作方法：
(1)取消毒的碟皿(直径5～8cm或略大)，放入少许Hanks液或PBS;
(2)将采取的小块组织先用PBS漂洗去组织表面的血污，剪成撕去附带的其它组织，如脂肪或多余的纤维、包膜等，切成5mm3左右大小的小块，放入碟皿内Hanks液或PBS中;
(3)用锋利手术刀或眼科剪将组织剪切成1mm3左右的碎组织块;
(4)将碎组织及Hanks液或PBS置于较松的组织研磨匀浆器内，用手缓慢研磨(可反复几次)，形成散在细胞的匀浆。
(5)将组织匀浆经40目或100目不锈钢网过滤去除纤维组织、血管及较大的凝块。
过滤时可用Hanks液或PBS冲洗;
(6)将过滤的细胞匀浆悬液直立静置片刻使较大的组织块及红细胞先沉淀，取上部细胞悬液，以Hanks液或PBS洗涤，离心，收集细胞;
(7)计算活细胞率，计数细胞，制备成所需浓度的细胞悬液。
注意：组织研磨匀浆器不能太紧，研磨时应缓慢，否则易使细胞
损伤、破碎、或增高死亡细胞率。
2.不锈钢网挤压法：
操作方法：
(1)将切取的组织块以PBS漂洗去表面血污，切成5～10mm3的组织块;
(2)在消毒碟皿内放少许Hanks液或PBS，把40目～100目的不锈钢网放入Hanks液或PBS中，将组织块置网上，用消毒注射器芯或试管的底端轻轻压挤组织，使其穿过网眼入Hanks液或PBS中。
同时，用Hanks液或PBS冲洗网上的组织。
最后，将网上剩余的纤维包膜或血管等弃去;
(3)收集Hanks液或PBS液中的细胞悬液显微镜检查，如仍有较多的小组织块，可用更细的不锈钢网(20μm)重复压挤1次;
(4)收集Hanks液或PBS细胞悬液。
1000r/min离心片刻使残留较大组织碎块及红细胞沉淀，吸取未沉淀的细胞悬液。
再以Hanks液或PBS洗涤，离心，收集1次;
(5)计数活细胞率及计算细胞数，制备所需浓度的细胞悬液。
注意：如经1次压挤尚有较多的碎组织块，也可用消毒注射器，带6号注射针头，将细胞及碎组织从注射器内经针头压出，使细胞再次分散。
3.吹打分离法：此法只适用于很松软的组织，如从脑组织分离胶质细胞。
操作方法：
(1)取小块脑组织，剥离脑膜，血管等纤维组织后，用Hanks液漂洗2次;
(2)在消毒碟皿中放约2～3倍于脑组织的Hanks液，将脑组织置Hanks液中，用滴管吸取Hanks液反复吹打脑组织使成悬液;
(3)将组织悬液经40目尼龙网过滤后，移入试管中直立静放5～10分钟，较大的组织碎块及红细胞下沉，脂肪及碎细胞片等漂浮在液体上部。
吸取中间部分的细胞悬液，并如此反复2～3次;
(4)取少许细胞悬液显微镜检查，如已制成较多的散在细胞悬液，可计数活细胞率。
计数细胞用Hanks液或适当的培养液制备成所需浓度的细胞悬液。
(二)EDTA分离法EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)，是一种螯合剂(chelatingagent)，能与组织内的Ca2+、Mg2+离子螯合而使细胞分离。
EDTA常用PBS等配成0.02%的工作液。
其作用温和，在一般情况下对细胞损伤较小，但分离效果并不很高。
可用于分离一些胚胎组织或肝脏灌流，不过较少单独使用，常和其它一些酶(如0.25%胰蛋白酶)混合使用(以1∶1或2∶1混合);但不要与胶原酶混合使用，因这种酶依赖Ca2+和Mg2+，与EDTA混合后可使胶原酶的消化作用严重障碍或失效。
与胰蛋白酶混合可用于分离培养细胞进行传代培养。
其方法是将培养细胞的培养液吸去后，加入0.02%EDTA与0.25%胰蛋白酶的混合液，以盖满细胞为度，处理3～10分钟，注意不能消化过度使细胞收缩脱落。
吸出消化液，立即用Hanks液洗涤2～3次
以洗去EDTA。
最后加入培养液，用滴管吹打使细胞脱落形成细胞悬液。
使用EDTA应注意分离时间不能过长。
因其对细胞的线粒体可有损伤，而且细胞长时间处于无Ca2+环境下(被EDTA螯合)则可使细胞内K+降低;同时呼吸减弱也可造成细胞损害。
(三)其他非酶分离细胞方法甘氨酸(glycine)也可用于分离细胞，如用含1mol/L甘氨酸与2mol/LEDTA的混合液分离海胆胚胎。
双糖(disaccharides)，如高张蔗糖、乳糖、麦芽糖等(常用0.5mol/L)可分离细胞间的缝隙连接或紧密连接等。
0.5%KOH的稀碱溶液(pH9.3左右)也可用于胚胎组织的分离。
但如将pH恢复正常，则分散的细胞又可再聚合。
二、酶分离细胞技术
可用于分离细胞的酶很多。
蛋白水解酶类有胰蛋白酶(trypsin)、胶原酶(collagenases)、弹性蛋白酶(elastase)、链霉蛋白酶(pronase)、溶菌酶(lysozyme)、木瓜蛋白酶(papain)等。
其它酶类有透明质酸酶(hyaluronidase)，脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease)等。
这些酶各有优缺点，对细胞的损伤也各不相同，所以对使用何种酶应按实验要求加以选择。
比较常用的有胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶等。
胰蛋白酶适于消化间质较少的组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等;对纤维性组织的消化能力较差。
Ca2+、Mg2+对其活性有抑制作用，故配制时应不含Ca2+或Mg2+，或与EDTA配伍使用。
胰
蛋白酶的工作浓度为0.01%～0.5%，常配成0.25%的工作液。
室温及37℃下消化比较恰当，4℃时仍有缓慢的消化作用。
最适工作pH为8～9左右。
消化时间最短(如胚胎组织)为20～30分钟，一般为30～60分钟，低温或低浓度时也可延长至12～18小时(过夜)。
胶原酶适用于消化分离纤维组织，对上皮、肝、胰、肾及一些癌组织的细胞分离也比较适用。
它有很多类型，Sigma厂的产品有1～Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅺ等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞或一般纤维组织，应按实验要求，按产品说明书选用。
胶原酶与胰蛋白酶不同，它必须在Ca2+及Mg2+存在的条件下，才能较好地活化。
常用的浓度为100～200U/ml(按说明书配制。
一般产品>125U/mg，故工作浓度常用0.05%～0.1%，高纯度胶原酶可为>1200U/mg或1000～3000U/mg)。
该酶的作用缓慢，常需较长的消化时间。
链霉蛋白酶为非特异性具有广谱性质的中性蛋白酶，适于分离消化道的粘膜上皮细胞及肝脏的Kupffer细胞。
其消化速度比胰蛋白酶快。
分离的消化道上皮存活率可高达96%左右，较其它酶优越。
透明质酸酶对间质中含多量透明质酸的组织比较适用，对热稳定，工作pH较宽，常可与其它酶配合使用以增加消化分离细胞的效果。
(一)胰蛋白酶消化分离细胞方法
操作方法：
1.在消毒碟皿中将组织剪切成3～5mm3左右的碎组织块;
2.在小烧杯内放入30～50倍的0.25%胰蛋白酶，加入剪切碎的组
织，在37℃水浴或温箱中消化30～60分钟，每隔5分钟左右摇荡1次(用电磁搅拌器拌搅亦可);
3.将消化的组织离心1000r/min10分钟，吸去上清液，以Hanks 液漂洗2～3分钟，再离心，去上清，重复3次以尽量洗去胰蛋白酶;
4.用100μm尼龙网或不锈钢网过滤，去除未消化分离的碎组织块、纤维等;
5.再以Hanks液漂洗，收集细胞悬液;
6.计数活细胞百分率，计数细胞数，用含4%小牛血清的PBS或Hanks液制备所需浓度的细胞悬液(加小牛血清不仅可以作为稳定剂，抑制分散的细胞凝聚;也可作为酶抑制剂，抑制与细胞表面结合的胰蛋白酶的消化作用)。
(二)胶原酶消化分离细胞方法
操作方法：
1.将切取的组织先用Hanks液或PBS洗净粘附的血污。
在碟皿内剪切成3～5mm3碎组织块;
2.在小培养瓶内加4～5ml培养液，放入数小块组织碎块，加入等量0.1%的胶原酶(终浓度约为100U/ml或0.05%)，pH6.5;
3.37℃温箱内消化4～48小时(不需摇荡)。
如消化缓慢，最长可延长至4～5天;
4.待组织碎块软散于瓶底，振荡培养瓶便成细胞悬液;
5.将细胞悬液离心1000r/min10～15分钟，去上清，以Hanks液漂洗，离心，去上清，并重复洗2～3次。
6.计数活细胞及细胞数，用含5%牛血清的新培养液制备所需浓度的细胞悬液。