高效阴离子交换色谱检测双歧杆菌胞外多糖的单糖组成_旭日花

单糖组成分析是多糖结构鉴定中必不可少的 研究内容。目前，测定多糖中单糖比例的方法主 要有气相色谱法和高效液相色谱法[4]。利用气相色 谱法测定单糖，样品需要被衍生化为易挥发、对 热较稳定的衍生物。然而，在衍生化反应过程中 易引起样品损失，产生的衍生物异构体也会对组 成分析产生干扰。常规高效液相色谱法检测糖类 时，通常采用示差检测器或紫外、荧光检则器。 其中示差检测器灵敏度较低；紫外或荧光检测器 检测多糖时同样存在衍生化所带来的一系列问 题[5]。然而，HPAEC- PAD 法操作简单，无须进行 衍生化，便能高效、准确地进行单糖组成分析， 是近年发展起来的分析糖类的一种方法。该方法 避免了因多糖衍生化而产生的异构体，使每种糖 都能得到单一的色谱峰，无溶剂峰的“拖尾”现 象，且离子色谱法具有很高的灵敏度，能对多糖 中的痕量单糖组分进行测定[6- 8]。
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它是一种包含有分支结构的由单糖或单糖衍生物 的重复单位组成的长链多糖[1]。按照组分不同，乳 酸菌产生的 EPS 可以分为同多糖和杂多糖两大类。 乳酸菌 EPS 对人体健康的潜在益生作用的研究表 明，EPS 既可以提高乳酸菌对肠道表面的非特异 性黏附，又有抗肿瘤、抗溃疡、免疫调节、降胆 固醇和调节血压等作用，对人类的健康有着重要 的意义[2- 3]。
本文从长寿老人源动物双歧杆菌 RH 的发酵液 中分离纯化出 2 个 EPS 组分，采用 HPAEC- PAD 法分析测定该双歧杆菌 RH 所产 EPS 的单糖组成， 并对 EPS 样品的水解条件进行探索。
1 材料与方法
1.1 试验材料 1.1.1 供试菌种 本实验室分离保存的产胞外多糖 动物双歧杆菌 RH：广西巴马长寿老人区。 1.1.2 试 剂 与 仪 器 L- Rhamnose、 L- Arabinose、 D- Galactose、D- Glucose、D- Mannose 和D- Fructose： Sigma 公司(质量分数 99％以上)；NaOH：Dionex 产 品；Millipore：超纯水；其他试剂：国产分析纯。
(33.47%)和 Fru(1.03%)，而 EPSb 含有 Rha(9.41%)，Ara(7.88%)，Gal(34.82%)，Glc(17.82%)，Man
(27.83%)和 Fru(2.24%)。
关键词： 双歧杆菌；胞外多糖；单糖组成；高效阴离子交换色谱
中图分类号： TS 207.4
文献标志码： A
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2011 年 第 36 卷 第 4 期
mm×50 mm)；流动相：A 为 H2O，B 为 200 mmol/L NaOH，线性梯度洗脱；在线自动脱气 GS50 四元梯 度 泵 ； ED50A 电 化 学 检 测 器 ， Au 工 作 电 极 ， Ag/AgCI 参比电极；进样体积：25 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；chromeleon 6.5 色谱工作站。
Abstract: Two fractions (EPSa and EPSb) were isolated and purified by ion -exchange chromatography on
DEAE-Sepharose Fast Flow column and gel-filtration chromatography on Sepharose CL-6B column. And then their sugar components were quantified by high -performance anion -exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). The results showed EPS sample could be hydrolyzed fully by adding 200 μL H2SO4 and 800 μL distilled water to hydrolyze for 2.5 h at 100 ℃. The monosacchrides analysis showed that EPSa was composed of Rha (1.00%), Ara (3.54%), Gal (18.13%), Glc (42.84%), Man (33.47%) and Fru (1.03%); then EPSb Rha(9.41%), Ara(7.88%), Gal(34.82%), Glc(17.82%), Man(27.83%) and Fru(2.24%).
文章编号： 1005-9989(2011)04-0246-04
Determination of monosaccharide composition of exopolysaccharides from Bifidobacteria by high performance anion exchange
DIONEX ICS- 3000 高效离子色谱仪：美国戴安 公司；DHL- A 电脑恒流泵、TH- 500 梯度混合器、 BS- 100A 自动部分收集器：上海青浦沪西仪器厂； ML54/02 电子天平：梅特勒 - 托利多仪器(上海)有限公 司 ； 玻 璃 离 子 交 换 柱 (2.6 ×20 cm)， 填 装 D EAE- SepharoseFastFlow、玻璃凝胶过滤柱(1.6 cm×80
1.8
OD490
NaCl 浓度
1.6
-2
1.4
1.2
NaCl/（mol/L）
Key words: Bห้องสมุดไป่ตู้fidobacteria; exopolysaccharides; momosaccharide; high performance anion exchange chro -
matography
胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)是 微生物 在 生长代谢过程中分泌到细胞外的荚膜或黏多糖，
pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)分别对 2 个组分的单糖组成进行了定性和定量测定。
结果表明，用 20% H2SO4 于 100 ℃水解 2.5 h，可将多糖完全水解。HPAEC-PAD 检测结果表明
EPSa 和 EPSb 均为杂多糖，EPSa 含有 Rha(1.00%)，Ara(3.54%)，Gal(18.13%)，Glc(42.84%)，Man
DOI:10.13684/ki.spkj.2011.04.066
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高效阴离子交换色谱检测双歧杆菌 胞外多糖的单糖组成
旭日花， 刘丽莎， 李平兰 * (中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)
cm)； 填 装 Sepharose CL- 6B： Pharmacia 公 司 ； RE- 52AA 旋 转 蒸 发 仪 ： 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ； FD- 1D 冷冻干燥机：北京博医康试验仪器有限公司。 1.2 试验方法 1.2.1 双歧杆菌 EPS 的提取 将双歧杆菌 RH 在产 糖培养基中 37 ℃厌氧培养 48 h，8000 r/min 离心 10 min 去除菌体，上清液减压浓缩后用 3 倍体积 无水乙醇 4 ℃沉淀 24 h。8000 r/min 离心 10 min 去 上清液，沉淀复溶于水，Sevage 法除蛋白 3 次后 于 4 ℃对水透析 48 h。透析袋内溶液减压浓缩后， 冷冻干燥得 EPS 粗品。 1.2.2 双歧杆菌 EPS 的纯化 1.2.2.1 DEAE Sepharose FF 离 子 交 换 柱 层 析 用 EPS 粗品配制成 10 mg/mL 糖溶液，0.45 μm 膜过 滤后，经 DEAE Sepharose FF 柱层析，上样量为 7 mL，依次用 0.05 mol/L Tris- HCl 缓冲液(pH7.50)和 含 1 mol/L NaCl 的 Tris- HCl 缓冲液线性梯度洗脱， 洗脱速度为 4 mL/min，每管 8 mL 部分收集，以葡 萄糖为标品采用苯酚 - 硫酸法逐管检测多糖含量 (A490 nm)[9]，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰 组分，对去离子水透析后，冷冻干燥。 1.2.2.2 Sepharose CL- 6B 柱层析 离子交换层析得 到的多糖各组分制成 10 mg/mL 糖溶液，0.45 μm 膜过滤后，经 Sepharose CL- 6B 柱层析，上样量 5 mL，用 0.05 moL/L NaCl 恒速洗脱，洗脱速度为 35 mL/h，每管 8 mL 部分收集，以葡萄糖为标品采用 苯酚 - 硫酸法逐管检测多糖含量(A490 nm)，按多糖含 量检测值分别合并收集单一峰组分，对去离子水 透析后，冷冻干燥。 1.2.3 双歧杆菌纯多糖的单糖组成分析 1.2.3.1 单糖标准曲线的绘制 分别精确称取干燥 至恒重 的单糖标准 品，制备 不 同 浓 度 (0.2、 0.5、 1.0、4.0 μg/mL 和 10.0 μg/mL)的 L- Rha、L- Ara、 D- Gal、D- Glc、D- Man 和 D- Fru 混合 标准溶液， 以单糖浓度(μg/mL)为横坐标，以峰面积(nC×min) 为纵坐标绘制每种单糖的标准曲线。 1.2.3.2 多糖水解 准确称取 5 mg EPS 纯品，加入 200 μL 浓 H2SO4 静置，添加 800 μL 蒸馏水，100 ℃水解 1.5 h 和 2.5 h，冷却后定容到 2 mL，用固 体 BaCO3 中和，5000 r/min 离心 10 min 除去杂质， 将上清液稀释 20 倍后，0.20 μm 微孔滤膜过滤后 进行高效离子色谱检测。 1.2.3.3 色谱条件 糖分析柱(CarboPacTM PA10，4 mm ×250 mm)； 糖 保 护 柱 (CarboPacTM PA10， 4