酶学分析技术2016
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酶学分析技术范文
酶学分析技术范文酶学分析技术（Enzyme Assay Techniques）是一种用于测定生物样品中酶活性的方法。
酶是生物体内广泛存在的催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶学分析技术在生物化学、医学、农业等领域都有重要的应用。
首先，酶学分析技术中最常用的方法之一是光度法。
光度法基于酶催化反应产生物质的颜色变化，并通过测量吸光度来确定酶活性的方法。
典型的酶学分析技术中，一种常用的测量指标是酶促反应后产生的NADH或NADPH的浓度。
通过比较反应前后的吸光度差异，可以计算出酶的催化速率。
其次，酶学分析技术中常用的另一种方法是荧光法。
荧光法基于酶催化反应后产生荧光分子的原理，通过测量荧光信号来确定酶活性的方法。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的特点，适用于检测低浓度的酶活性。
常用的荧光剂包括荧光底物和荧光探针，可以通过酶催化反应后的荧光信号强度或颜色变化来确定酶活性。
此外，酶学分析技术中还有其他一些常用的方法，例如比色法、电化学法和质谱法等。
比色法通过测量反应物质的颜色变化来确定酶活性，常用的比色剂有碘化钠、邻联二硝基苯胺等。
电化学法基于酶催化反应过程中产生的电流变化来确定酶活性，常用的电极包括氧化还原电极、工作电极和对比电极等。
质谱法利用质谱仪分析酶催化反应产物的质荷比来确定酶活性，可以用于分析复杂的代谢途径和检测微量物质。
总的来说，酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中有着广泛的应用。
通过研究酶的活性和底物/产物之间的关系，可以了解酶的催化机制和生理功能。
酶学分析技术不仅可以用于检测酶的活性、底物和产物的含量，还可以用于筛选和优化酶的性质，例如通过变异酶突变、构建重组酶等方法。
此外，酶学分析技术还可以用于药物研发、生物工程和环境监测等领域。
总结起来，酶学分析技术是一种用于测定生物样品中酶活性的重要方法。
其原理和实验步骤多种多样，常用的方法包括光度法、荧光法、比色法、电化学法和质谱法等。
酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中具有广泛的应用，可以了解酶的催化机制、优化酶的性质，以及在药物研发、生物工程和环境监测等领域中的应用。
酶学分析技术
金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚 金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。 血清ALP 与底物作用15min 1mg 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm 血清在25℃ 3.0ml,光径 时每分钟测定吸光度下降0.001 即消耗4.82 0.001， 10NADH为一 时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 × 10-4μmol NADH为一 个卡门氏单位
线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（ 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受 相对于时间（min） 的程度 。
前半段△A/min－后半段△A/min］ ［（前半段 A/min＋后半段△A/min）/2］ 100％ 前半段△ 线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％
17
（二）Km的含义与意义 的含义与意义
的含义: 1．Km的含义:
V max =[S]时 可见K 值等于反应速率达到最大反应速率V 当Km=[S]时， v = ，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax 2 一半时的底物浓度。 一半时的底物浓度。
2．Km的意义 Km的意义
Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 是酶的一个特征性常数 ），Km 反映酶对底物亲和力 酶对底物亲和力的大小 反映酶对底物亲和力的大小 最适底物或天然底物 选择酶的最适底物 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率 判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应 判断酶偶联反应的限速反应 计算工具酶的用量 计算工具酶的用量
线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（ 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受 相对于时间（min） 的程度 。
前半段△A/min－后半段△A/min］ ［（前半段 A/min＋后半段△A/min）/2］ 100％ 前半段△ 线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％
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（二）Km的含义与意义 的含义与意义
的含义: 1．Km的含义:
V max =[S]时 可见K 值等于反应速率达到最大反应速率V 当Km=[S]时， v = ，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax 2 一半时的底物浓度。 一半时的底物浓度。
2．Km的意义 Km的意义
Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 是酶的一个特征性常数 ），Km 反映酶对底物亲和力 酶对底物亲和力的大小 反映酶对底物亲和力的大小 最适底物或天然底物 选择酶的最适底物 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率 判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应 判断酶偶联反应的限速反应 计算工具酶的用量 计算工具酶的用量
酶学分析技术课件优秀课件
·L·V标
实际保温时间
四、酶促反应进程
酶促反应进程曲线
酶量的测定：
通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确 测定酶量，应使酶浓度（〔E〕）与酶促反应速度成 正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。 能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速 度，即酶促反应初速度。
酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应 速度才能准确代表酶活性。
(四)Km和Vmax的测定
1．Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法
1 Km +〔S〕 Km 1
1
—— = ————— = ——— · —— + ———
v Vmax〔S〕 Vmax 〔S〕 Vmax
2．Cornish-Bowden作图法 又称为直线线性作图法。
第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
五、酶促反应底物动力学
中间产物学说：
酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催
化底物反应生成产物。E + S ES → E + P
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
特点： 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。
注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分 钟为宜。
（二）连续监测法
定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。
原理：
该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产 物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图 ，绘制反应速度曲线。
生化检验 酶学分析技术
第五章酶学分析技术名词解释酶：由活细胞产生的具有特异性和高效催化率的一类蛋白质。
辅酶：与蛋白质结合疏松的结合酶。
多是维生素或维生素衍生物。
工具酶：作为试剂用于测定代谢物浓度或酶活性的酶。
酶活性：在规定条件下，单位时间内底物减少的量或产物生成的量。
即酶促反应的速度。
（线性期的酶促反应速度才能准确代表酶活性）酶活性单位：在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需的酶量。
一个人为规定的标准。
有惯用单位、国际单位和Katal单位三种。
国际单位：1IU指在规定条件下（25℃，最适pH，最适底物浓度），每分钟转化1μmol底物所需要的酶量。
常将IU简写成I。
K m：等于酶促反应速度达最大值一般时的底物浓度。
、K m越大，酶与底物亲合力越小K m越小，酶与底物亲合力越大米-曼氏方程：V = V max × S / S+K m。
可以导出K m =（V max - V)S / V定时法：又称终点法、两点发。
底物与酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
反应时间是t1~t2。
操作简单但难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。
速率法：在酶促反应期间每隔一段时间测定一次产物或底物变化量，根据变化量间接求出酶活性浓度。
连续观察反应进程，可在线性期测定酶活性，标本和试剂用量少，可在短时间内完成，但要求高，要精确控制温度、pH和底物浓度等。
指示酶：血浆特意酶：在血浆中发挥特定催化作用的酶。
问答题1、酶活性测定的速率法与终点法有何不同？答：①终点法是指测定反应开始后一段时间内（t1~t2）产物的生成量或底物的消耗量以测定的方法。
②速率法是指在酶促反应期间每隔一段时间测定一次产物或底物变化量，根据变化量间接求出酶活性浓度。
③速率法无需终止酶促反应，不需要添加其他显色试剂就可以测定反应物的变化，很容易观察反应整个过程，可在线性期测定酶活性，结果准确可靠，标本和试剂用量小。
《酶法分析》课件
酶的分类和特性
酶的分类
酶的种类：包括氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂合酶、异 构酶等
酶的活性：受温度、pH值、离 子强度等因素影响
酶的来源：包括动物、植物、 微生物等
酶的稳定性：受温度、pH值、 离子强度等因素影响
酶的特性
酶是一种生物催化剂，可以加速化 学反应的速度
酶的活性受温度、pH值、离子强 度等因素的影响
法
酶法分析的应 用领域广泛， 包括食品、医 药、环境等领
域
酶法分析的发 展趋势是向着 自动化、微型 化、高通量方
向发展
酶法分析的未 来前景广阔， 有望在更多领
域得到应用
对未来发展的展望
酶法分析技术在生物医学领域的应用前景 酶法分析技术在环境监测领域的应用前景 酶法分析技术在食品检测领域的应用前景 酶法分析技术在工业生产领域的应用前景
酶法分析在生物体内的应用实例：例如，酶法分析可以用于检测血液中的葡萄糖、血脂、胆固醇等 物质，也可以用于检测尿液中的蛋白质、尿素、肌酐等物质。
酶法分析在生物体内的发展趋势：随着生物技术的不断发展，酶法分析在生物体内的应用将会越来 越广泛，越来越深入，为疾病的诊断和治疗提供更加准确、快速的信息。
食品分析中的酶法分析
《酶法分析》PPT课件
汇报人：PPT
目录
添加目录标题
01
酶法分析的实验技术 和方法
04
酶法分析概述
02
酶的分类和特性
03
酶法分析的应用实例
05
酶法分析的优缺点和 未来发展前景
06
添加章节标题
酶法分析概述
酶法分析的定义和原理
酶法分析：利用酶的生物催化作用，对样品进行定性、定量分析的方法
酶学分析技术二
有些同工酶的变化可在总 酶变化之前发生
对某些疾病的预后有评价价值
线粒体酶的测定
16
临床常用血清酶分析
17
P166
一、转氨酶（ Aminotransferases ）及其同工酶
丙氨酸氨基转移酶 (Alanine aminotransferases，ALT) / 谷丙转氨酶 GPT
天冬氨酸氨基转移酶 (Aspartate aminotransferases，AST/ 谷草转氨酶 GOT
又称：γ-谷氨酰转肽酶 （ γ-GTP/GGTP)
1. 催化反应
一种含巯基的线粒体酶，可催化γ-谷氨酰基从谷胱甘肽 （GSH）或其它含γ-谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基 酸分子上。 GSH＋氨基酸
GGT
γ-谷氨酰氨基酸＋半胱氨酰甘氨酸
22
P167
2. 组织分布
肾脏中含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的 GGT主要来自肝胆。
3. 标本
GGT较稳定，室温下可放置2d， 4℃可存放1w， -20℃可储存1y；RBC中几乎无GGT，因此溶血标本可以检 测。
23
P168
4. 临床意义
(1) 肝胆疾病检出阳性率最高的酶 有助肝胆疾病的鉴别诊断 胆道疾病，GGT阳性率高，而且升高明显，可高达530ULN，肝实质疾病是GGT一般只是中度升高，可达25ULN 与ALP联合进行肝脏疾病检测 若ALP升高而GGT正常，则完全排除ALP的肝来源，若 ALP和GGT都增加，则应先排除肝外引起GGT增加的原 因，一旦排除，则GGT增高为肝病所致。
7
P145
（三）排出异常
肾功能减退，血清AMY活性升高可能 因酶排泄障碍而在血液中滞留。 胆道梗阻，血清ALP升高的原因是梗 阻区ALP合成加强，ALP排泄受阻而逆 流入血。 大多数酶，不存在以上的清除机制。
对某些疾病的预后有评价价值
线粒体酶的测定
16
临床常用血清酶分析
17
P166
一、转氨酶（ Aminotransferases ）及其同工酶
丙氨酸氨基转移酶 (Alanine aminotransferases，ALT) / 谷丙转氨酶 GPT
天冬氨酸氨基转移酶 (Aspartate aminotransferases，AST/ 谷草转氨酶 GOT
又称：γ-谷氨酰转肽酶 （ γ-GTP/GGTP)
1. 催化反应
一种含巯基的线粒体酶，可催化γ-谷氨酰基从谷胱甘肽 （GSH）或其它含γ-谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基 酸分子上。 GSH＋氨基酸
GGT
γ-谷氨酰氨基酸＋半胱氨酰甘氨酸
22
P167
2. 组织分布
肾脏中含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的 GGT主要来自肝胆。
3. 标本
GGT较稳定，室温下可放置2d， 4℃可存放1w， -20℃可储存1y；RBC中几乎无GGT，因此溶血标本可以检 测。
23
P168
4. 临床意义
(1) 肝胆疾病检出阳性率最高的酶 有助肝胆疾病的鉴别诊断 胆道疾病，GGT阳性率高，而且升高明显，可高达530ULN，肝实质疾病是GGT一般只是中度升高，可达25ULN 与ALP联合进行肝脏疾病检测 若ALP升高而GGT正常，则完全排除ALP的肝来源，若 ALP和GGT都增加，则应先排除肝外引起GGT增加的原 因，一旦排除，则GGT增高为肝病所致。
7
P145
（三）排出异常
肾功能减退，血清AMY活性升高可能 因酶排泄障碍而在血液中滞留。 胆道梗阻，血清ALP升高的原因是梗 阻区ALP合成加强，ALP排泄受阻而逆 流入血。 大多数酶，不存在以上的清除机制。
酶学分析技术
优点：多点测定结果，连接成线，很 容易找到成直线的区段，因而可选择线性 反应期来计算酶活性，不需终止反应，测 定结果较准确。省时、省试剂。 缺点：分光光度计必须有保温装置， 而且P或S应是可直接测定的化合物，如需 加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活 性是否有影响。
三、影响酶活性测定的因素
（一）样品处理的影响 1. 溶血 RBC中某些酶活性比血高，如 LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。 2. 抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，如 EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+ 的AMS和需 Mg2+ 的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都 用血清。
（1）温度的选择 37℃反应速度快，单位 时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保 温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较 少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学 较难定在30℃进行，IFCC建议30℃作为参考 方法的标准温度。 （2）温度系数 将温度每升高10℃后反应 速度相当于原来的倍数，称为温度系数(Q10)。 Q10表示温度对反应速度影响的大小。
比活性是衡量酶纯度的一个指标，比活
性高，表示酶制剂中杂蛋白的含量少， 酶纯度高。
二、酶活性单位的计算
酶活性单位的计算，实际上就是计算 单位时间内底物或产物的变化量。计算公 式
酶 单 位/ 升＝ 产物的增加量 每单位规定的保温时间 每 单 位 规 定 的 产 物 增量 加 实际保温时间
1000 (ml) 实际标本用量（ ml）
3. Katal单位 为了与法定计量单位 （SI）接轨，1972年国际酶学委员会又提 出的一种新单位，是指在最适条件下，每 秒使1mol底物发生变化的酶量。
1 Kat=60×106IU
1 nKat=0.06IU 1 IU=16.67nKat
《酶学分析技术》课件
04 酶学分析技术的应用实例
在生物工程领域的应用
通过酶学分析技术，可以深入了解生物分子的 结构和功能，为生物工程领域的研究提供有力
支持。
在生物工程领域中，酶学分析技术对于新药研发、疫 苗生产、生物制品质量控制等方面也具有重要意义。
酶学分析技术在生物工程领域中有着广泛的应 用，如蛋白质组学研究、基因表达分析、代谢 组学研究等。
《酶学分析技术》PPT课件
目录
• 酶学分析技术概述 • 酶的分类与特性 • 酶学分析技术的基本原理 • 酶学分析技术的应用实例 • 酶学分析技术的未来展望
01 酶学分析技术概述
酶学分析技术的定义与特点
总结词
酶学分析技术是一种利用酶的催化特性进行物质检测和分析的方法，具有高特异性、高灵敏度和高选择性等特点 。
详细描述
通过改进酶的提取和纯化技术、酶的固定化 技术、酶反应动力学研究等手段，可以提高 酶学分析技术的准确性和灵敏度。同时，创 新性的酶学分析方法和技术也将不断涌现， 例如酶联免疫分析、酶传感器、酶反应动力
学分析等。
酶学分析技术在其他领域的应用拓展
总结词
随着酶学分析技术的不断发展和完善，其应用领域将 不断拓展，为其他领域的发展提供有力支持。
详细描述
酶学分析技术是利用酶的生物催化作用，通过测量反应产物或底物浓度变化来推算酶活性或酶含量的技术。由于 酶具有高特异性、高灵敏度和高选择性等优点，因此酶学分析技术在生物、医学、农业、工业等领域具有广泛的 应用价值。
酶学分析技术的应用领域
总结词
酶学分析技术广泛应用于生物、医学、农业、工业等领域，如临床生化检验、食品安全 检测、环境保护等。
详细描述
酶学分析技术不仅在生物工程、制药、环保等领域有 广泛应用，还可以应用于食品安全检测、农业残留检 测、生物安全等领域。随着技术的进步和应用需求的 增加，酶学分析技术的应用领域将进一步扩大。
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组织细胞 体液：以血浆或血清为主
测定方法：
酶质量测定：绝对质量，以g/L为表示单位
酶活性测定：相对质量，以U/L为表示单位
(一)、酶活性浓度表示方法
酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应 速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的 减少量。
表示方法： v d[P] dt
指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最 适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活 性 或代谢物浓度。
16
(一)、酶促反应机制 E + S ES → E + P
米-曼氏方程(数学表达式)
Vmax〔S〕
v = —————
〔S〕+ Km
v 代表反应速度 Vmax 代表最大反应速度 〔S〕 代表底物浓度
= Vmax / [E] 计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）
20
（二）、Km与Vmax的应用
1. Km的计算
2.鉴定酶的种类
Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与 酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种 类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。
第五章
酶学分析技术
1
ห้องสมุดไป่ตู้
第一节 酶学分析技术基本知识
简介内容：
一、酶的基础知识 二、酶含量的表示方法 三、酶促反应动力学 四、酶促反应进程
2
一、酶的基础知识
3
酶（enzyme）：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂
酶的组成和命名
胰蛋白水解酶
酶的催化特点：
高效性、高度特异性、高度不稳定性、可调节性
19
Vmax的含义
定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完 全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。
应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每 个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。
计算公式为：
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol） (单位是s-1)
国际单位IU 25℃
单位U 37℃
3．Katal单位
✓定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。1Katal＝1mol/s。
IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal
10
酶活性浓度
酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用 IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情 况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.
优点： 1、灵敏度高； 2、特异性高 3、无活性酶蛋白测定 4、适于同工酶测定
不足： 1、抗体难以制备；2、方法繁杂；3、测定成本高
三、酶促反应动力学
15
研究内容：(初速度,单因素)
研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶 活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学 。
研究意义:
8
1．惯用单位：
20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位
✓举例：
ALP的金氏单位（King） 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）
金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。
卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径 1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 10-4μmol NADH为一个卡门氏单位
由于酶的特异性强，催化反应的速度快，反应条件温和等， 因此酶试剂一般化学试剂，具有更高的特异性和灵敏度， 更易于自动化，可为临床更加及时地提供准确的检验信息。
酶的应用：
酶活性/含量的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型 测定用于临床诊断和疗效判断。
4
二、酶含量的表示方法
5
酶测定标本及方法类型
标本：
或
v d[S] dt
式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。
7
酶活性单位
定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法：
➢惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） ➢国际单位IU（µmol/min） ➢Katal单位（mol/s）
·L·V标
实际保温时间
正常上限升高倍数（ULN）
概念：某标本酶活性测得的结果除以该法正常参考范围上 限所得倍数。
酶活性实测值
即ULN＝
正常参考范围上限
例：如某人血ALT测定结果为80u/L，该测定方法正常 参考范围上限为40mmol/L，其ULN＝80/40＝2
(二)、酶质量浓度表示方法
原理：用免疫学技术直接测定酶的质量，以质量浓度单位 报告结果。如ng/ml或μg/L等。
表.某些酶的Km值
酶
底物
Km(mmol/L)
乳酸脱氢酶 己糖激酶
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
丙酮酸 D-葡萄糖 D-果糖 D-乳糖
H2CO3
H2O2 蔗糖 甘氨酰酪氨酰甘氨酸
0.017 0.05 1.5 4.0 9.0 25 28 108
3.反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。
Km 米氏常数
Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价 值。
Km的含义:
当Km=[S]时，v Vm2a，x 可见Km值等于反应速率达 到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。
Km的意 义：
➢Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 ➢鉴别酶的种类 ➢反映酶对底物亲和力的大小 ➢选择酶的最适底物或天然底物 ➢设计适宜的底物浓度
✓特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较 少。
9
2.国际单位IU（µmol/min）IFCC3,72℃001年
✓定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol
底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。
11
计算公式:
产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×————————
每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）
分光光度法测定的公式：
（A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间
酶单位/升 = —————————×————————
测定方法：
酶质量测定：绝对质量，以g/L为表示单位
酶活性测定：相对质量，以U/L为表示单位
(一)、酶活性浓度表示方法
酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应 速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的 减少量。
表示方法： v d[P] dt
指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最 适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活 性 或代谢物浓度。
16
(一)、酶促反应机制 E + S ES → E + P
米-曼氏方程(数学表达式)
Vmax〔S〕
v = —————
〔S〕+ Km
v 代表反应速度 Vmax 代表最大反应速度 〔S〕 代表底物浓度
= Vmax / [E] 计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）
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（二）、Km与Vmax的应用
1. Km的计算
2.鉴定酶的种类
Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与 酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种 类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。
第五章
酶学分析技术
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ห้องสมุดไป่ตู้
第一节 酶学分析技术基本知识
简介内容：
一、酶的基础知识 二、酶含量的表示方法 三、酶促反应动力学 四、酶促反应进程
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一、酶的基础知识
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酶（enzyme）：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂
酶的组成和命名
胰蛋白水解酶
酶的催化特点：
高效性、高度特异性、高度不稳定性、可调节性
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Vmax的含义
定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完 全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。
应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每 个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。
计算公式为：
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol） (单位是s-1)
国际单位IU 25℃
单位U 37℃
3．Katal单位
✓定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。1Katal＝1mol/s。
IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal
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酶活性浓度
酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用 IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情 况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.
优点： 1、灵敏度高； 2、特异性高 3、无活性酶蛋白测定 4、适于同工酶测定
不足： 1、抗体难以制备；2、方法繁杂；3、测定成本高
三、酶促反应动力学
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研究内容：(初速度,单因素)
研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶 活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学 。
研究意义:
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1．惯用单位：
20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位
✓举例：
ALP的金氏单位（King） 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）
金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。
卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径 1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 10-4μmol NADH为一个卡门氏单位
由于酶的特异性强，催化反应的速度快，反应条件温和等， 因此酶试剂一般化学试剂，具有更高的特异性和灵敏度， 更易于自动化，可为临床更加及时地提供准确的检验信息。
酶的应用：
酶活性/含量的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型 测定用于临床诊断和疗效判断。
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二、酶含量的表示方法
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酶测定标本及方法类型
标本：
或
v d[S] dt
式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。
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酶活性单位
定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法：
➢惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） ➢国际单位IU（µmol/min） ➢Katal单位（mol/s）
·L·V标
实际保温时间
正常上限升高倍数（ULN）
概念：某标本酶活性测得的结果除以该法正常参考范围上 限所得倍数。
酶活性实测值
即ULN＝
正常参考范围上限
例：如某人血ALT测定结果为80u/L，该测定方法正常 参考范围上限为40mmol/L，其ULN＝80/40＝2
(二)、酶质量浓度表示方法
原理：用免疫学技术直接测定酶的质量，以质量浓度单位 报告结果。如ng/ml或μg/L等。
表.某些酶的Km值
酶
底物
Km(mmol/L)
乳酸脱氢酶 己糖激酶
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
丙酮酸 D-葡萄糖 D-果糖 D-乳糖
H2CO3
H2O2 蔗糖 甘氨酰酪氨酰甘氨酸
0.017 0.05 1.5 4.0 9.0 25 28 108
3.反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。
Km 米氏常数
Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价 值。
Km的含义:
当Km=[S]时，v Vm2a，x 可见Km值等于反应速率达 到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。
Km的意 义：
➢Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 ➢鉴别酶的种类 ➢反映酶对底物亲和力的大小 ➢选择酶的最适底物或天然底物 ➢设计适宜的底物浓度
✓特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较 少。
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2.国际单位IU（µmol/min）IFCC3,72℃001年
✓定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol
底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。
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计算公式:
产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×————————
每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）
分光光度法测定的公式：
（A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间
酶单位/升 = —————————×————————