凝胶电泳缓冲液的配制
琼脂糖凝胶电泳 配方与步骤
�RNA琼脂糖凝胶电泳：配制：1.0.5M EDTA（pH=8.0）：100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌，用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。
2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0）500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。
3.1×TAE loading buffer:取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。
4.100×Sybergreen：500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸避光保存。
注意：Sybergreen原液需稀释10000倍；6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。
步骤：1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml):称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3.加样:样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul100×Sybergreen：0.1ulDEPC水：至10ul(注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳试剂：溴酚蓝指示剂点样缓冲液，电泳缓冲液（TAE），40 mmol/L Tris-乙酸，1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml），0.8% 琼脂糖凝胶（配制方法：称取琼脂糖0.4克，加入50ml TAE电泳缓冲液）实验步骤1．调节电泳槽平面至水平。
检查稳压电源与正负极的线路。
2．选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。
3．制备0.8%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。
4．用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。
待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。
倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。
5．琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6．将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。
如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。
7．将蛋白样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。
上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。
8．用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。
9．盖上电泳槽，开启电源开关，80V恒压电泳30-60分钟，使蛋白从负极向正极移动，电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，考马斯亮蓝染色。
脱色液配制1L：600ml去离子水，无水乙醇300ml，冰醋酸100ml。
凝胶电泳缓冲液的配制
2．测序凝胶加样缓冲液98%去离子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青FF0.025%溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。
不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与D owexXG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用What man 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。
3．常用的电泳缓冲液说明：①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。
以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。
但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。
目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
②碱性电泳缓冲液应现用现配。
③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4．2×SDS凝胶加样缓冲液100mmo l/L Tris·HCl(6.8)200mmo l/L二硫苏糖醇（DTT）4%SDS（电泳级）0.2%溴酚蓝20%甘油不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。
5．凝胶加样缓冲液使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。
溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2. 2倍，而与琼脂糖浓度无关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
8%聚丙烯酰胺凝胶电泳
50ml配方：
30%丙烯酰胺：13.33ml
10×TBE：5ml（或者5×TBE加10ml）
TEMED：25ul
10%过硫酸铵（新鲜配制）：250ul
ddH2O:补到50ml
丙烯酰胺30%为29：1（质量比，丙烯酰胺：双甲叉丙烯酰胺）
电泳槽中加入0.5×TBE
银染液的配制：
固定液: 100mL 冰乙酸加水稀释至1000mL，可重复使用；
染色液: 1g AgNO3、1. 5mL 37%甲醛, 加水至1000mL (4摄氏度预冷效果佳)，可重复使用，棕色瓶存放；
显色液: 30g Na2 CO3、1. 5mL 37% 甲醛、0. 2mL Na2S2O3(10mg/mL) , 加水至1000mL；
终止液：配方同固定液，10%冰乙酸，可以用回收的固定液进行终止。
染色：
1、加入固定液固定30min，水洗5-10min；
2、加入染色液染色30min，水洗2次，每次不超过30s；
3、加入显色液显色（条带清晰即可，一般不超过5min）；
4、加入终止液终止反应；
需要配制的溶液：
10%过硫酸铵：称取5g过硫酸铵溶解于50ml蒸馏水中。
37%甲醛：37ml甲醛和63ml蒸馏水混匀。
10mg/mL Na2S2O3：称取0.3g溶解于30ml蒸馏水中。
10%冰乙酸：100mL 冰乙酸加水稀释至1000mL，可重复使用。
5×TBE缓冲液：54gTris，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水定容至1升。
琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制
琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制附录5:琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳。
它们包括Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液(pH8.0，TAE，也称作E缓冲液)、Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)或Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)，工作液浓度约50nm0l/L，工作pH7.5-7.8。
各种电泳缓冲液通常配制成浓溶液存放(表5-3)。
表5-3 电泳缓冲液缓冲液工作液贮存液/LTAE 1 × 50 ×40 mmol/L Tris-乙酸盐 242 g Tris;37.2g NaEDTA.2HO; 221 mmol/L EDTA 搅拌溶解;57.1 ml冰乙酸;充分搅拌后定容至1000 ml。
TPE 1× 10 ×90 mmol/L Tris-磷酸盐 108 g Tris2 mmol/L EDTA 15.5 ml磷酸(85%，1.679)40 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)TBE* 0.5 × 5 ×45 mmol/L Tris-硼酸盐 54 g Tris; 3.72g NaEDTA.2HO; 221 mmol/L EDTA 27.5 g硼酸;充分搅拌溶解后定容至1000ml。
* TBE通常作为5×或10×的贮存液配制和贮存。
这种浓的贮存液pH应为8.3左右，它在应用前稀释，并用同一种贮存液制备凝胶溶液和电泳缓冲液。
有些研究者习惯用更浓的TBE贮存液，如10×的。
但是5×的贮存液更稳定，因为贮存期间溶质不沉淀。
上述三种缓冲液都工作得很好。
三者之中TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗。
此时的凝胶的阳性一侧将发生酸性化，凝胶中向阳极迁移的溴酚蓝的顔色呈从蓝紫色到黄色的变化，故需定期更换缓冲液。
电泳琼脂糖凝胶的配制
电泳琼脂糖凝胶的配制
配制电泳琼脂糖凝胶的步骤如下：
1. 准备所需材料，包括琼脂糖粉、缓冲液、电解质溶液、蒸馏水等。
2. 根据实验的需要，根据琼脂糖的浓度选择适当比例的琼脂糖粉，一般浓度为0.8-2%。
3. 将所需缓冲液加入容器中，根据实验需要选择适当的缓冲液，例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液等。
4. 在缓冲液中加入适量的琼脂糖粉，搅拌均匀，可以使用磁力搅拌器。
5. 根据实验需要，在琼脂糖溶液中添加适量的电解质溶液，例如SDS、尿素等，用于改变凝胶的性质。
6. 使用蒸馏水将溶液补充至所需体积，同时搅拌均匀，确保溶液中无颗粒。
7. 将准备好的琼脂糖溶液加热至70-80摄氏度，使其完全溶解。
8. 静置琼脂糖溶液至室温，或者加入适量冷却剂，如冰块，以加快冷却过程。
9. 将准备好的琼脂糖溶液倒入凝胶模板中，避免气泡的产生。
10. 等待凝胶完全固化，通常需要约30分钟至1小时。
11. 凝胶固化后，根据实验需要在凝胶上形成孔洞，以供电泳样品加入。
以上是电泳琼脂糖凝胶的简要配制步骤，具体的实验条件和步骤可以根据实验的要求进行调整。
SDS-PAGE电泳相关溶液的配置
电泳相关溶液的配置：1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）：称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，过滤，4摄氏度保存一个月。
2、5×SDS电极缓冲液：称取Tris base15.1g，甘氨酸94.g，SDS 5.g 加dH2O定容至1000ml。
3、2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTris·Cl （pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。
4、染色液的配制（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml锥形瓶中，用蒸馏水加以补足至1000ml。
加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。
充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。
当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。
5、脱色液（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中，待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用。
收集液的SDS-PAGE分析：1、取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。
分离胶配方Resolving Gel (10ml)6%8%10%12%15%H2O 5.4 4.7 4.1 3.4 2.430% acrylamide mix 2.0 2.7 3.3454x resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.520% SDS0.050.050.050.050.0520% APS0.050.050.050.050.05TEMED0.0080.0060.0040.0040.004浓缩胶配方（10ml）H2O 6.9 ml30% acrylamide mix 1.7 ml8x stacking-gel buffer1.25 ml20% SDS0.05 ml20% APS0.05 mlTEMED0.01 ml2、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。
电泳缓冲液的配制和琼脂糖凝胶的配制
电泳缓冲液的配制和琼脂糖凝胶的配制常见的电泳缓冲液为TAE缓冲液（三乙酸-乙酰胺-乙酸缓冲液）和TBE缓冲液（硼酸-三乙酸-乙酰胺缓冲液）。
下面以TAE缓冲液为例，介绍一种常见的配制方法：所需试剂及材料：1.TAE缓冲液粉末2.蒸馏水3.磷酸氢二钠（NaH2PO4）4. 乙酸（Acetic acid）5. 乙酰胺（Amp-urea）6.称量器具7.搅拌器8.常温（25°C）高精度pH计配制步骤：1.根据实验需要，计算所需配制的缓冲液的体积。
2.准备用于配制的容器，并将其清洗干净。
3.称取相应质量的TAE缓冲液粉末，加入到容器中。
4.加入适量的蒸馏水，将粉末溶解均匀。
5.将NaH2PO4（磷酸氢二钠）溶解在蒸馏水中，搅拌至溶解均匀。
6.加入乙酸和乙酰胺，搅拌均匀。
7.使用pH计测量溶液的pH值。
8.如果pH值不在所需范围内（通常为8.0），可以加入适量的乙酸或乙酰胺进行调节，直到达到所需pH值。
9.最后，使用蒸馏水将溶液体积补足至所需配制的总体积。
琼脂糖凝胶的配制方法：琼脂糖凝胶是一种常用的电泳试剂，用于分离DNA、RNA或蛋白质等生物大分子。
它的主要成分是琼脂糖（Agarose），其配制方法如下：所需试剂及材料：1.琼脂糖粉末2.TAE或TBE缓冲液3.电泳仪4.中性漂洗液（例如盆子中洗涤剂）5.温度计6.凝胶模具7.干净容器配制步骤：1.准备用于配制琼脂糖凝胶的容器，并将其清洗干净。
2.根据实验需要，计算所需配制的琼脂糖凝胶的质量。
3.将琼脂糖粉末称取出来并加入容器中。
4.加入适量的TAE或TBE缓冲液，使其覆盖住琼脂糖粉末。
5.将容器密封，并放入微波炉中加热,或者可以使用传统的加热方法，将容器放进加热水浴中进行加热。
6.加热至琼脂糖完全溶解，通常需要3-5分钟。
7.轻轻摇晃或用棒子搅拌溶液，确保溶液均匀混合。
8.将溶液冷却至约55-60°C。
在冷却过程中，可以使用温度计不断监测温度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2．测序凝胶加样缓冲液
98%去离子甲酰胺
10mol/L EDTA(pH8.0)
0.025%二甲苯青FF
0.025%溴酚蓝
甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。
混合床树脂不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG
8
共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。
3．常用的电泳缓冲液
缓冲液使用液浓贮存液（每升）
Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/L Tris-乙酸50×：242g Tris碱
0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/L Tris-磷酸10×:10g Tris碱
0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）
40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/L Tris-硼酸5×：54g Tris碱
0.001mol/L EDTA 27.5硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b1×:50mmol/L Na OH 1×:5ml 10mol/L NaOH
1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c1×:25mmol/L Tris5×:15.1g Tris
250mmol/L 甘氨酸94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）
0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级)
说明：
①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。
以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。
但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。
目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
②碱性电泳缓冲液应现用现配。
③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4．2×SDS凝胶加样缓冲液
100mmol/L Tris·HCl(6.8)
200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）
4%SDS（电泳级）
0.2%溴酚蓝
20%甘油
不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L
贮存液现加于上述缓冲液中。
5．凝胶加样缓冲液
缓冲液类型6×缓冲液贮存温度
Ⅰ0.25%溴酚蓝
4℃0.25%二甲苯青FF
40%（W/V）蔗糖水溶液
Ⅱ0.25溴酚蓝
室温0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖(Ficoll400)
Ⅲ0.25%溴酚蓝
4℃0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液
Ⅳ0.25%溴酚蓝
4℃40%(W/V)蔗糖水溶液
碱性加样缓冲液:
300mmol/L NaOH
6mmol/L EDTA
Ⅴ18%聚蔗糖(Ficoll400)
4℃0.15%溴甲酚绿
0.25%二甲苯青FF
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。
溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2. 2倍，而与琼脂糖浓度无关。
以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。
在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。
但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。