1 分子克隆解析
生物学实验室中的分子克隆技术
生物学实验室中的分子克隆技术分子克隆技术是生物学中非常重要的技术之一，它可以用于生物学研究、医学诊断、基因治疗等方面。
而生物学实验室中的分子克隆技术也是其中重要的一环。
下面让我们来了解一下生物学实验室中的分子克隆技术。
什么是分子克隆技术？分子克隆技术就是将DNA从一个物种中剪切出来，然后将其插入到另一个物种的DNA中，从而制造出具有新的遗传特征的重组DNA。
这种技术可以在DNA分子水平上对基因进行操作，而且是一种广泛应用于分子遗传学和生物化学的技术。
分子克隆技术在生物学实验室中的应用生物学实验室中的分子克隆技术有很多应用，下面介绍一下几个比较常见的应用。
1. 基因克隆分子克隆技术可以用于基因克隆。
这种技术可以从一个物种中分离出一个基因并进行改组，然后插入到另一种物种的DNA中。
通过基因克隆，可以研究某个特定基因的功能以及作用机制。
基因克隆也可以用于设计药物、疫苗和农作物改良等领域。
2. 亚克隆亚克隆技术是一种通过制造DNA片段并插入到克隆向量（如质粒）中来实现的分子克隆技术。
亚克隆技术可以用于分析基因功能、生物学过程、新药开发等领域。
此外，亚克隆技术也可以用于产生大量的DNA片段，以用于DNA测序等分子生物学实验。
3. PCR扩增PCR扩增是一种用于扩增特定DNA序列的方法。
PCR扩增利用酶的催化作用，在高温条件下在目标DNA片段两端分别链接一个引物，然后进行DNA复制和扩增。
基因组DNA或cDNA如此扩增后，可以进行克隆、测序或其他实验。
PCR扩增技术可用于分析DNA序列变异和DNA指纹鉴别。
这些都是分子克隆技术在生物学实验室中应用的一些例子。
分子克隆技术的应用非常广泛，可以用于基础研究和应用研究。
这种技术的应用正在不断扩展，将来还有很大潜力。
分子克隆技术的发展分子克隆技术的发展与进步可以追溯到上世纪70年代，这是DNA重组技术的诞生时期。
此后，在分子克隆技术的不断发展和完善下，许多新技术得以发展出来，如亚克隆、PCR扩增、RT-PCR等技术。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
分子克隆技术的原理与应用
分子克隆技术的原理与应用克隆，是指从一群细胞或组织中选择某一个细胞或组织，以其为“母细胞”或“母组织”，通过某些手段将其分裂繁殖得到多个完全相同的个体的过程。
在生物学领域中，分子克隆技术指的是利用重组DNA技术，从已知的DNA片段中复制、扩增相同的DNA片段。
分子克隆技术不仅在基础研究中有着重要的应用，更广泛地被应用于生物科技产业中。
一、分子克隆技术的原理1. DNA的限制酶切割制备DNA切割物质，首先需要用限制酶对DNA进行切割，选取限制酶根据需要选择合适的酶切位点。
限制酶对DNA的酶切产物可通过凝胶电泳分离和纯化。
通过酶切方法将所需的DNA片段提取出来，为下一步的操作做好准备。
2. DNA片段的扩增目标DNA片段扩增是分子克隆技术的关键步骤。
常用的扩增技术是聚合酶链式反应（PCR），该技术可以将微小的DNA样品扩增到可以用于研究的数量级。
PCR的过程将目标DNA的核酸链通过加热分离，然后通过引物在酶的催化下进行扩增。
3. DNA片段的连接寻找合适的载体将扩增的DNA片段连接到其中。
目前最常用的载体是质粒，把所需的DNA与载体DNA共同酶切，将目标DNA与载体DNA连接并接入质粒的DNA链。
连接后的DNA称为重组DNA或克隆。
4. 载体转化将重组DNA转化到细菌中，让其自我复制，实现DNA片段的大量复制。
二、分子克隆技术的应用1. 基础研究分子克隆技术在基础研究中有很重要的应用。
可以用该技术产生带有特定基因突变的转基因动植物，使研究人员不仅能够了解不同基因突变的物种特性，而且还可以评估潜在起育种和治疗作用。
2. 诊断医学分子克隆技术在医学诊断方面的应用也非常广泛，可用于人类遗传疾病的诊断和研究。
在DNA指纹分析等场景中，可以通过比对不同样本的DNA来确定样本的亲缘关系和识别身份。
3. 生物工程分子克隆技术在生物工程领域的应用主要在于生产和制造。
利用分子克隆技术可以生产大量优质的种子和动植物株，或者生产工业化化学品、生物农药等。
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
分子克隆原理
分子克隆原理分子克隆是生物学中一种重要的技术手段，它是指利用分子生物学技术对DNA进行复制和重组，从而得到与原始DNA相同或相似的分子。
分子克隆技术的应用范围非常广泛，涉及基因工程、药物研发、农业生产等多个领域。
本文将介绍分子克隆的原理及其在生物学研究和应用中的重要性。
首先，分子克隆的原理是基于DNA的复制和重组。
DNA复制是生物体细胞分裂时进行的一种重要过程，它使得细胞在分裂时能够传递遗传信息。
而分子克隆则是通过模拟DNA复制的过程，将目标DNA片段复制出来，并将其插入到载体DNA中，从而得到包含目标DNA片段的重组DNA分子。
这样一来，就可以在细胞内大量复制目标DNA片段，为后续的研究和应用提供充足的材料。
其次，分子克隆的关键步骤包括DNA片段的获取、载体DNA的选择、连接和转化。
首先，需要从生物体中提取目标DNA片段，这可以通过PCR技术或限制性内切酶切割等方法来实现。
然后，需要选择一个合适的载体DNA，一般来说，质粒是最常用的载体，因为它具有独立的复制和表达机制。
接下来，将目标DNA片段和载体DNA进行连接，一般采用DNA连接酶来实现。
最后，将重组的DNA分子导入到宿主细胞中，通过细胞内的复制和表达机制，使得目标DNA片段得以大量复制和表达。
分子克隆技术在生物学研究和应用中具有重要的意义。
首先，它为基因工程和生物技术的发展提供了重要的技术手段。
通过分子克隆，可以对目标基因进行定点突变、基因组编辑等操作，从而揭示基因的功能和调控机制。
其次，分子克隆也为药物研发和生物医学研究提供了重要的工具。
许多重要的药物和治疗方法都是基于分子克隆技术的发展而来。
此外，分子克隆还在农业生产中发挥着重要作用，例如转基因作物的育种和疾病抗性的培育等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物学技术手段，它基于DNA的复制和重组原理，通过一系列的操作步骤，可以实现对目标DNA片段的复制和重组。
分子克隆技术在生物学研究和应用中具有重要的意义，为基因工程、药物研发、农业生产等领域提供了重要的技术支持。
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Gus first exon Catalase intron Gus second exon Histidine tag
Bst EII
Mazie Ubiquitin promotor
Kpn I (11754) Sal I Hin dIII (11015) Bst XI
Nos poly-A
CaMV35S promoter
pU1301+1.5KB外源
• 双酶切： BamHI+KpnI
ALPHA
pUC19
Eco RI (397 )
P(BLA)
Acc 65 I (409) Ava I (41 3) Xma I (41 3) Kpn I (41 3) Sma I (41 5 )
AP rБайду номын сангаас
pUC19
2686 bp
Bam HI (41 8) Pst I (440) Hin dIII (448)
Xho I (9995)
PU1301
T-Border (right)
14336 bp
pVS1 sta
hygromycin (R)
Xho I (8901)
CaMV35S polyA T-Border (left)
Sac II
pVS1 rep
kanamycin (R)
pBR322 bom pBR322 ori
实验材料
携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻 DNA 片段的 pU1301 载体的大肠杆菌 菌液。
操作步骤
1. 取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应
抗生素的 LA 培养基上涂布或划线分离单菌落，
37℃过夜培养）；
2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗
生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜
7.
12000 g离心10分钟；
8.
吸取800l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂 质）至另一个 1.5ml 离心管中，加入 2/3 体积的 异丙醇，室温下放置5分钟；
12000 g 常温离心15分钟；
1. 是一个复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携 带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增； 2. 有 1 到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于 外源基因的插入； 3. 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)，以此 知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体 的细胞从其他细胞中分离出来。
第一部分：分子克隆技术
将外源（某载体上的水稻）DNA
片段亚克隆到另一载体上。
pU1301
CaMV 35S promoter
Hin dIII (13575)
Terminator
Bam HI Sma I Kpn I (13246)
TEV Leader
Eco RI (13066) Eco RI (12426) Nco I (12076) Nco I (1)
培养；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心1分钟，收集菌体， 倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽 量将菌液倒干净； 4. 加入300l Solution I振荡打匀，重新悬浮细胞， 震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300l Solution II，轻柔颠倒混匀，放置至 清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 6. 加入300l Solution III颠倒混匀，放置于冰上10 分钟，使杂质充分沉淀；
P(LAC) ORI
分子克隆的主要步骤
1. 两种载体的抽提
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量
3. 两种载体的限制性内切酶消化
4. 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化
5. 载体与外源DNA的连接 6. 感受态细胞的制备 7. 连接子转化感受态细胞 8. 重组子筛选及鉴定
质粒载体的提取
载体必备条件
试剂的作用（二）
Solution III 中和后，宿主 DNA 由于很大，碱基 还未来得及配对就在冰冷的条件下与 SDS、蛋白 质、高分子量的 RNA 等缠绕在一起沉淀下来， 而质粒 DNA 由于很小且双链未分开，能够迅速 配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。
试剂的作用（三）
1. 苯酚/氯仿： 纯化质粒，去除质粒溶液中残留的 蛋白质等杂质； 2. 无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA 3. TE 或H2O：溶解质粒DNA
质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或 表达外源基因的主要载体，它在基因操作中具有 重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验
技术。
质粒的基本特点
双链闭合环状 DNA分子，具有自主复制和转录 能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表 达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中， 也可整合到细菌染色体上。 质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞 周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个 拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝 数较多，一般在细胞内有20个以上）。
TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） EDTA （pH 8.0） 苯酚/氯仿 无水乙醇或异丙醇 10 mM 1 mM
试剂的作用（一）
Solution I: 重悬细菌; Solution II: 其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞 内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打 开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的 质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开;
碱裂解法用到的试剂
Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 µ g/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1% Solution III: Final concentration KAC 1.32 M Using HAC to adjust pH to 4.8
质粒的提取
碱裂解法，主要包括4个步骤： 1. 细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的 培养基中，培养至对数生长后期；
2. 菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理
裂解细胞； 3. 染色体DNA 、RNA 及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的 KAC 缓冲液处理后离心； 4. 质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀。