分子克隆全过程
分子克隆的基本步骤
分子克隆的基本步骤嘿，各位科学小达人，今天咱们就来聊聊分子克隆的基本步骤，这可是实验室里的“高级魔术”，我保证，听完我的讲解，你也能变成一个“DNA巫师”。
首先，得准备好我们的“魔法材料”，也就是那些瓶瓶罐罐里的“液体宝贝”。
什么“PCR试剂”、“限制酶”、“连接酶”啦，这些都是我们“克隆大业”的必备良药。
第一步，来个“DNA热舞派对”，也就是PCR扩增。
把我们的目标DNA扔进“PCR机器”里，让它跟着高温曲线一起“热舞”，直到它“子孙满堂”，复制出成千上万的DNA副本。
第二步，给DNA来个“精致修剪”，这就是传说中的“酶切反应”。
我们用限制酶这个“分子剪刀”把DNA切成我们想要的形状，这可是个精细活儿，稍微手一抖，就可能变成“DNA碎片”。
接下来，是“DNA联姻”环节，也就是“连接反应”。
我们把修剪好的DNA片段和载体DNA“牵线搭桥”，让它们在连接酶的“见证”下，成为“一家人”。
这就像是在实验室里举办了一场“分子婚礼”。
然后，是“细胞变身”时间，也就是“转化反应”。
我们把连接好的DNA“送入”细菌细胞，让它们变成“DNA搬运工”。
这个过程就像是在细胞界搞了一场“特工行动”。
紧接着，得来个“D NA身份验证”，也就是“筛选转化子”。
我们把这些“可能怀孕”的细胞放在含有抗生素的培养基上，只有那些成功“怀孕”的细胞才能存活下来，这就像是在玩“细胞版”的“谁是卧底”。
最后，我们要进行“DNA产前检查”，也就是“DNA测序”。
通过测序，我们可以确认我们的克隆是否“健康成长”，没有出现“基因突变”这类“家庭悲剧”。
总之，分子克隆这事儿，听起来高大上，其实就是一场实验室里的“魔法表演”。
只要掌握了这些“咒语”和“魔法棒”，你也能在DNA的世界里，玩转“克隆大法”。
别忘了，每个科学家心里都住着一个小巫师，分子克隆，只是我们施展魔法的一部分！。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆详细步骤
分子克隆详细步骤分子克隆是通过重组DNA分子来产生大量完全相同的DNA序列的技术。
在分子克隆工作中，我们主要进行克隆载体的构建、目标DNA的扩增、将目标DNA插入克隆载体中、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍这些步骤：1.克隆载体的构建：克隆载体是用于插入目标DNA的DNA分子。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
在构建克隆载体时，我们首先需要选择适合的载体，并提取载体的DNA。
然后，利用酶切酶对载体进行酶切，生成线性的载体DNA。
接下来，将目标DNA插入克隆载体的相应位点上，形成重组的载体。
2.目标DNA的扩增：目标DNA可以通过PCR（聚合酶链反应）来扩增。
首先，设计引物，使其与目标DNA的两端末端相互互补。
然后，在PCR反应中，通过DNA聚合酶的扩增作用，使目标DNA得以扩增。
PCR反应通常包括模板DNA、引物、核苷酸和聚合酶等成分。
3.目标DNA的插入：将扩增后的目标DNA与酶切后的载体进行连接，利用DNA连接酶催化目标DNA与载体之间的连接反应，生成重组的克隆载体。
连接后的载体含有目标DNA的序列。
4.转化：将克隆载体引入宿主细胞中进行复制。
这一步骤通常称为转化。
转化可以通过电击、热激、化学方法等方式进行。
宿主细胞通常是大肠杆菌等细菌。
5.筛选：利用筛选方法来选择包含目标DNA的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、报告基因筛选和限制性内切酶酶切筛选等。
抗生素筛选是将带有选择性抗生素耐受基因的克隆引入含有相应抗生素的培养基中，只有带有目标DNA的克隆才能生长。
报告基因筛选是通过将报告基因插入克隆载体中，使之与目标DNA一起被转录和翻译，从而表达报告基因的蛋白质，以此来筛选包含目标DNA的克隆。
限制性内切酶酶切筛选是通过限制性内切酶对重组载体和目标DNA进行酶切，并通过凝胶电泳的方法来分离并检测含有目标DNA的克隆。
以上就是分子克隆的详细步骤。
通过这些步骤，我们可以获得大量完全相同的DNA序列，并用于各类分子生物学研究和应用中。
分子克隆实验指南
分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。
这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。
分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。
2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。
3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。
4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。
5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。
下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。
2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。
3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。
5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。
6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。
7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。
8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。
9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。
总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
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本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程
克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序
1) 基因组DNA提取（以家蚕为例）
1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在
冰上充分研磨，转入5ml的离心管；
2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h；
3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h；
4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管；
5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清；
6. 重复5，再抽提1次；
7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次
8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的
无水乙醇，充分混匀，4℃过夜
9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。
用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干；
10. 200µl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA；
11. 检测OD值；
12. 做好标记，以供进一步实验之用。
2) 感受态细胞的制备
1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时；
2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2∼2.5 h，
使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成）
4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中，
冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！）
5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清；
6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h
后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。
可以保存至少6个月。
3) PCR
1、PCR反应体系：
ddH2O 37.7 μL
10×PCR buffer 5 μL （25mM）
dNTP 4 μL
引物1/2 1μL/1μL
Taq酶 0.3μL
模板 1μL
PCR反应体系总体积 50 μL
充分混匀，稍离心。
2、PCR反应条件
Step 1 94℃ 5min
Step 2 94℃ 30s;
Step 3 55℃ 1 min;
Step 4 72℃ 1 min 30 s;
Go to step2 35 cycles;
72℃ 10 min ；
4℃保温
3、PCR完成后，取3μL电泳检测大小是否正确。
玻璃奶法纯化回收DNA片段，-20℃保存供进一步实验之用。
4) 玻璃奶纯化回收
1.对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
2.电泳后的胶在紫外光下切割目的片段；
3.放入EP管称重（此步可以大概估计一下，称重太麻烦），加入3倍体积的6M NaI;
4.65℃水浴至胶完全溶解；
5.加入glass-milk充分混匀。
冰上放置10分钟（中间摇2-3次）；
6.12000rmp5-10S，去上清；
7.沉淀用600μlNewWash或75%乙醇洗3次（充分弹起）；
8.37℃烘干，0.1×TE溶解（30μl左右），37℃5-10min促进溶解；
9．12000rmp 2min,上清即为回收的DNA，用时不要动沉淀。
5) 酶切
酶切体系：
PCR产物 12 μl
10×K buffer 3 μl
EcorI/BamHI 1/1 μl
DdH2O 13 μl
Total30 μl
37℃ 2h酶切; 65℃ 15min,使酶失活
6) 连接
连接体系：
10×Ligase buffer 1 ul
PGEM4Z（EcorI/BamHI酶切）0.2 ul
目的片段（酶切产物） 7.8 ul
T4DNA Ligase 1 ul
Total 10 ul
16℃ 9h左右。
注：所有试剂、PCR、酶切、连接体系均为本实验所用，别的实验请自行调整！
7) 质粒DNA的转化
1. 连接混合物5 μl加到200 μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴
30 min；
2. 再进行热休克，42℃保温2 min，迅速置冰上1∼2 min，加入1 ml已温育至
37℃的LB培养基；
3. 37℃振荡培养1－2 h，3000rmp/min稍离心，去部分上清（800μl左右，确
保够涂板用）后涂布于数个含80 μg/ml Amp的LB平板上。
37℃倒置培养过夜。
8) 挑菌摇菌
挑取单菌落于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培养10h左右（根据菌液混浊程度而定）。
9) 质粒抽提
1. 取过夜培养液1.5 mL 于Eppendorf中,5000 rpm,5 min，收集菌体细胞
2. 真空吸去上清后，向沉淀中加150 μL SolutionⅠ，振荡器混匀，室温放置15
min，
3. 加300 μL Solution Ⅱ,150 μL氯仿，轻轻混匀，冰上放置5 min。
4. 加450 μL的Solution Ⅲ，充分混匀后，冰浴10 min或更长的时间。
5. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，将上清转移到新的1.5 mL 的Eppendorf中，
加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴10 min或更长时间。
6. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，去掉上清，沉淀用250 μL的TER溶解，（TER：
1×TE中含20μg/mLRNase）,37 ℃保温20 min。
7. 再加入300 μL的PPT沉淀Buffer，4℃沉淀20 min，
8. 12000 rpm,5 min，沉淀用75%的酒精洗一次，37℃烘干直到没有酒精味道，
9. 用0.1×TE溶解DNA，-20℃备用。
10) 酶切鉴定
酶切体系：
DNA 4 μl
10×K buffer 1.5 μl
EcorI/BamHI 0.5/0.5 μl
ddH2O 8.5 μl
Total 15 μl
37 ℃2h.
进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
11) 测序
对鉴定正确的细菌做成甘油菌寄到生物公司测序
甘油菌制备：
1. 取100ul鉴定正确的菌液于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培
养7h左右（根据菌液混浊程度而定）；
2. 分装至EP管中，每管加入3-4滴甘油，摇匀。
用封口膜封装。