鸡贫血病毒全长感染性分子克隆的构建
鸡传染性贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析
鸡传染性贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析邓显文;谢芝勋;谢丽基;刘加波;谢志勤;庞耀珊【摘要】为了解鸡传染性贫血病毒(CIAV)广西分离株全基因变异情况,设计3对特异性引物,对CIAV广西分离株(GXC060821)的全基因进行PCR扩增、克隆和序列分析.结果显示,广西分离株的全基因为2 292个核苷酸,含有3个互相重叠的开放阅读框(ORF).序列分析表明,本CIAV分离株与国内外其他31个CIAV毒株比较核苷酸的同源性在96.1%～98.5%之间,推导氨基酸的同源性在89.8%～94.2%之间.全基因系统发育进化树分析显示,广西分离株和中国的TJBD40株、LF4株都处于一个分支,它们的亲缘关系较近,而与美国的98D06073分离株及中国的HA4分离株的亲缘关系较远.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2011(032)004【总页数】4页(P19-22)【关键词】鸡传染性贫血病毒;全基因组;克隆;序列分析【作者】邓显文;谢芝勋;谢丽基;刘加波;谢志勤;庞耀珊【作者单位】广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2;S858.31鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(CIAV)引起的,可引起3周龄以内的鸡严重贫血、出血,骨髓和淋巴器官严重萎缩[1]。
随着鸡年龄增长对CIAV的抵抗力增强,成年鸡感染后不出现任何临床症状,但种鸡可将CIAV垂直传播给其子代,引起子代发生传染性贫血;临床上CIAV感染鸡群常伴发或继发其他疾病,甚至引起疫苗免疫失败等。
近几年的流行病学调查表明,CAIV在我国鸡群中的感染非常普遍,感染率高达40%～96%[2-3],导致了巨大经济损失。
鸡贫血病毒广州株VP3和VPI基因的克隆与序列分析
２ ０ １ ５ 年（ 第４ ０ 卷） 第２ 期
试验研 究 ・ ２ ５ ・
鸡贫血病 毒广州株 Ｖ Ｐ ３和 Ｖ Ｐ １ 基 因的克隆与序 列分 析
沈海 燕 ，张建 峰 ，刘 志成 ，周 恒 一 ，郭 翠丽 ． 一 ，郭鹏举 １ ，张春 红 Ｈ （１ ． 广东 省农 业科 学 院动物 卫生研 究所 ，广 东省 兽 医公共 卫 生公共 实验 室 ，广东 省畜 禽疫病 防 治研 究 重点 实验 室 ， 广东 广广 东 广州 ５ １ ０ ６ ４ ２）
ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ｒｏ ｆ ｍ Ｇｅ ｎ Ｂａ ｎ ｋ ． Ｐ ｈ ｙ ｌ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｔ ｒ ｅ ｅ ｎａ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｈａ ｔ ｔ ｈｅ ｔ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ＣＡＶ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｇｕ ｎｇ ａ ｚ ｈ ｏ ｕ ｗｅ ｒ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｓ ｅ ｔ ｏ Ｔ Ｊ ＢＤ４ ０ ， Ｓ Ｄ２ ２ ， ｎｄ ａ Ｓ Ｄ２ ４ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｃｈ ｎａ ｉ ， ｂ ｕ ｔ ｔ ｈ ｃ ｙ ｗｅ ｒ ｅ ｆ ａ ｒ ａ ｗａ ｙ ｒｏ ｆ ｍ Ｍａ ｌ ａ ｙ ｓ ｉ ａ Ｓ ＭＳ Ｃ一 １
Ｃ Ａ Ｕ ２ ６ ９ ／ ７ 株 的亲缘 关 系较 远 。
关键词：鸡贫血病病毒；核苷酸序 列；分子进化树
中 图分 类 号 ：￥ ８ ５ ４ ． ４ ３ 文 献标 识码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１ ０ ０ ５ — ８ ５ ６ ７ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ — ０ ０ ２ ５ — ０ ４
Ｈｅ ａ ｌ ｈ， ｔ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｉ ａ ｌ Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｖ ｅ ｓ ｔ ｏ ｃ ｋ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｉ ｔ ｏ ｎ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ １ ０ ６ ４ ０ ， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ
鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析
鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析杨勇;任玉红;梁宝怀;朱雅宁;梁智选【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2007(37)2【摘要】参考已发表的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP1基因序列,设计并合成了2对引物,经PCR扩增获得了2个基因片段。
将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体中,成功构建了克隆载体pGEM-CIAVVP1A和pGEM-CIAVVP1B。
将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdeⅠ+EcoRⅠ、NdeⅠ+XhoⅠ双酶切,并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中,构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VP1B。
在0.3 mmol/L IPTG诱导下,目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。
Western-blot分析发现,表达蛋白具有CIAV抗原性。
表达蛋白经纯化后作为包被抗原,用间接ELISA鉴定,与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。
2组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。
【总页数】5页(P140-144)【关键词】鸡传染性贫血病毒;VP1基因;原核表达;酶联免疫吸附试验【作者】杨勇;任玉红;梁宝怀;朱雅宁;梁智选【作者单位】山西农业大学动物科技学院;山西省大同市南郊区畜牧局;天津市禽病诊断培训中心【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2;Q786【相关文献】1.鸡传染性贫血病毒VP1基因的原核表达 [J], 冯昕;荣俊;匡红艳2.鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因共表达载体的构建 [J], 陈降华;周庆丰;刘忠华;李文平3.鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析 [J], 向毅勇;罗薇;靳艳玲;刘内生;刘群;龙虎4.鸡传染性贫血病毒vp1基因的克隆表达及抗原性分析 [J], 杨勇;任玉红;梁宝怀;朱雅宁;梁志选5.鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达 [J], 鄢明华;赵晓岩;刘长军;王笑梅;王端;李刚;秦运安;邓国华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立
鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立王景儒;杨晓静【摘要】According to the sequence of chicken infectious anemia virus (CIAV) strain published in GenBank,two pairs of primers were designed and synthesized. The outer primers amplified a fragment of 485 bp in length, and the inner primers amplification fragment size was 297 bp in length. A nested PCR assay for rapid detection of ALV was established. A specific 297 bp fragment was amplified from DNA templates of CAV strain,but no bands were amplified with templates extracted respectively from avian influenza virus (AIV) subtype H9,Newcastle disease virus (NDV), infectious bursal disease virus (IBDV),egg drop syndrome virus (EDSV), reticuloendotheliosis (REV), avian reovirus (ARV) and Marek's disease virus (MDV). Sensitivity of the 1st and 2nd amplifications by the nested PCR assay were 100 pg and 1 fg,respectively. The sensitiv-ite of the 2nd amplifications increased by 105 times. The results showed that the nested PCR was specific,sensitive,rapid,and accurate,and could be used as a routine assay for the detection of CAV. This method had good reproducibility, specificity and sensitivity, and might detect low content CAV accurately and rapidly. This method could be used as a method for the diagnosis and detection of clinical cases,and molecular epidemiological investigation of CAV.%本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测.结果显示,该方法能扩增到297 bp 的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性.该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10 5倍.本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)004【总页数】4页(P55-58)【关键词】禽传染性贫血病病毒;套式PCR;检测【作者】王景儒;杨晓静【作者单位】辽宁朝阳工程技术学校,辽宁朝阳 122000;辽宁朝阳工程技术学校,辽宁朝阳 122000【正文语种】中文【中图分类】S858.31鸡传染性贫血（chicken infectious ane mia，CIA）是由鸡传染性贫血病毒（chicken inf ectious ane mia virus，CIAV或CAV）引起，以雏鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血及高死亡率的一种免疫抑制性疫病（Schat，2009）。
鸡贫血病毒哈尔滨分离株全基因克隆和序列分析
鸡贫血病毒哈尔滨分离株全基因克隆和序列分析何成强;丁乃峥;李景鹏;李云龙【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2002(042)004【摘要】通过PCR方法克隆了从哈尔滨分离的一株鸡贫血病毒(CAV)的全基因,并对其进行了测序,该病毒基因组为环状,全长2298bp,含有三个互相重叠的开放读码框和一个调控区.将克隆的基因与GenBank收录的CAV基因比较,同源性至少为97%,未发现与本次克隆的CAV基因完全一致的分离株.与德国分离株Cux-la、26p4和马来西亚分离株分别有42、42和72个核苷酸不同,同源性分别为98.2%、98.2%和96.9%.与德国分离株Cux 1b相比,除在调控区内少一个类似增强子的重复序列外,尚有39处核苷酸不同.它与分离于欧洲的几株CAV的亲源性要比来自亚洲的马来西亚株近.对CAV哈尔滨分离株、26p4、Cux-1b、Cux-1a和马来西亚株的VP1、VP2和VP3蛋白比较,VP2的保守性最高.【总页数】6页(P436-441)【作者】何成强;丁乃峥;李景鹏;李云龙【作者单位】山东师范大学生物系,济南,250014;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;山东师范大学生物系,济南,250014【正文语种】中文【中图分类】Q785;S852.65【相关文献】1.浙江省9株猪链球菌2型分离株Cps2J全基因克隆与序列分析 [J], 姚苹苹;王复甦n;朱函坪;梅玲玲;叶菊连;罗进;张政;姚晨辉2.PRRSV 广西分离株 GXYL-1403全基因克隆与序列分析 [J], 林思远;洪绍锋;黄加滨;韦莹;陈樱;黄伟坚;韦祖樟3.鸡贫血病毒哈尔滨分离株VP2基因克隆测序和比较 [J], 何成强;丁乃峥;李景鹏;李云龙4.鸡贫血病毒山东分离株全基因克隆 [J], 陈奖励;辛九庆5.广西三黄鸡鸡贫血病毒分离株GXC060821的全基因组序列分析 [J], Xie Z;谢冰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达
鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达杨雨辉;陈奖励【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2000(016)004【摘要】目的:为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征.方法:采用PCR方法获得鸡贫血病毒的VP2基因,采用平端连接将其克隆到PUC119载体上进行测序,采用粘端连接将其亚克隆到PET载体上并进行原核表达.结果:发现CAV-SJ1株的VP2基因共有651个碱基,同国外TK5803、26P4、Cux-1、82-2毒株的VP2基因相比分别有6、7、8、7个碱基的差别,其中3个是SJ1株特有的碱基变化.由基因序列推导出的CAV-SJ1株VP2蛋白的氨基酸序列同这些毒株相比都有4个氨基酸的差别,同国外这些毒株共有7个氨基酸的差别.原核表达的融合蛋白分子量为34Kd,占菌体蛋白含量的10.5%.结论:CAV的分子生物学的特性较稳定,变化不大.【总页数】3页(P224-226)【作者】杨雨辉;陈奖励【作者单位】中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪细小病毒YL株序列分析及其VP2基因原核表达 [J], 时乐;黄勇;许信刚;童德文2.传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达 [J], 黄春旭;许信刚;童德文;王志昇n;杜谦;唐麒麟;宁蓬勃3.大片吸虫成虫FG0018表达序列标签序列的电子克隆分析及实验验证 [J], 罗洪林;郑小龙;张为宇;覃华;黄维义4.4株IBDV分离株VP2基因的序列分析及原核表达 [J], 肖跃强;管宇;李书光;刘吉山;王金良;郭广君;沈志强5.广灵驴FTO基因克隆、序列分析及组织差异表达 [J], 邱丽霞;关家伟;李丽;李武峰;杜敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达黄冬艳;杨兵;齐欣;陈小玲;徐福洲【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2006(021)005【摘要】根据鸡贫血病毒Cux-1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因.将扩增出的片段克隆到pGM-T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux-1株的VP1基因序列一致.然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET-32a(+)载体上并进行原核表达.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应.【总页数】4页(P50-53)【作者】黄冬艳;杨兵;齐欣;陈小玲;徐福洲【作者单位】江西农业大学,动物科学院,江西,南昌,330045;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;沈阳农业大学,畜牧兽医学院,辽宁,沈阳,110161;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.重组A型FMDV VP1基因乳酸杆菌穿梭表达质粒的构建及在大肠杆菌BL21中的表达 [J], 王淼;周鹏;潘丽;张永光 Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因C末端在大肠杆菌中的表达与纯化 [J], 韩建成;王保海;刘晃;曾江勇;王宝闯3.鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化 [J], 吴艳红;陈建龙;李丛丛;何成强;李云龙4.肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达 [J], 唐启慧;田新贵;林斌;向开军;周荣5.鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析 [J], 刘岳龙;秦爱建;金文杰;叶建强;吉荣;崔治中;段玉友因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析
鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析赵锋;李学花;林世武;郭文杰;杨明;徐增强;邱建东;李进;张瑞【摘要】将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1.将pET32a-vp1转化E.coliplys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达.纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性.本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)008【总页数】5页(P34-38)【关键词】鸡传染性贫血病毒;vp1;原核表达【作者】赵锋;李学花;林世武;郭文杰;杨明;徐增强;邱建东;李进;张瑞【作者单位】太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027【正文语种】中文【中图分类】Q786鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）是免疫抑制性疾病鸡传染性贫血病（chicken infectious ane mia）的主要病原，其不但引起骨髓等造血组织萎缩，导致严重贫血甚至死亡，且引起胸腺等淋巴组织萎缩，进而导致免疫抑制，从而对其他病毒、细菌和真菌易感，因此会造成鸡新城疫、传染性法氏囊病及鸡马立克氏病等疫苗的免疫失败（Hassan等，2011）。
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鸡贫血病毒全长感染性分子克隆的构建
1 材料和方法
1.1毒株、载体和细胞
CAV毒株由本实验室分离、保存，pBluescript ⅡSK(+)载体、大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存；MDCC-MSB1细胞
1.2 主要试剂
限制性内切酶KpnⅠ,Ncol，T4DNALigase,小牛肠碱性磷酸酶，PrimesTARWHsDNA Polymerase, DNAMarker;质粒小量提取试剂盒，核酸凝胶回收试剂盒;PCR产物纯化试剂盒;其他试剂( )。
1.3 引物设计与合成
根据CA VCux-l株序列，设计一对引物IU、IL扩增CA V
全长基因组，利用引物将基因组1902位的碱基G替换为A，从而在不改变编码氨基酸的前提下引入KpnⅠ酶切位点作为分子标签；为了在拯救病毒过程中，检测分子标签的存在，设计引物P13和P16用来扩增含有分子标签的VP1基因。
引物序列见表1
表1 PCR引物序列
Table1 Primers sequence of PCR
引物名称引物序列引物位置NameofPrimers SequeneesofPrimers Position
IU 5’一GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC一3’1920一1940 IL 5’一AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC一3’1925一1905 P13 5’一ATCTGCAGGTAAGATGGCAAGACGAG一3’848一865
P16 5’一AACTGCAGTTTTCAGGGCTGCGTCC一3’2189一2205 注:下划线代表酶切位点，阴影代表突变的碱基。
1.4 重组质粒pBluem2CA V的构建和鉴定
1.4.1 CA V全长基因组的获取
由CA V鸡胚中提取基因组，以此为模板，用引物IU、IL进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性5min，98℃变性10s,68℃退火延伸3min30s,30个循环，72℃延伸10min，扩增后产物用核酸凝胶回收试剂盒回收。
回收后产物用KpnⅠ酶切，回收备用。
1.4.2 重组质粒pBluemCA V的构建和鉴定
pBluescript载体用KpnⅠ酶切，回收纯化后，再用小牛肠碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，回收纯化后，与KpnⅠ酶切的基因组连接，转化E.coliDH5α感受态细胞。
挑取单个菌落培养，提取质粒，进行PCR、KpnⅠ酶切及测序鉴定。
所有操作都参照《分子克隆》（第三版）进行。
1.4.3 重组pBluem2CA V的构建和鉴定
提取1.4.2中鉴定为阳性的质粒，通过改变KpnⅠ酶的作用浓度及反应时间来摸索最佳的不完全酶切条件，将阳性质粒进行不完全酶切，回收纯化不完全酶切产物，去磷酸化处理后，与1.4.1中处理的基因组进行连接，转化E.coliDH5α感受态细胞。
挑取单个菌落培养，提取质粒，进行酶切鉴定，同时用载体通用引物进行测序，进一步证实两个基因组是否顺向连
入载体。
1.5 pBluem2CA V转染MDCC-MSB1细胞。