分子克隆全攻略
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
分子克隆流程
分子克隆流程分子克隆呀，就像是一场微观世界里的神奇魔法。
咱先说说这第一步，得把目标基因给找出来。
这就像是在基因的大森林里找一棵特别的树。
有时候这基因藏得可深了，你得各种找线索，像是基因的一些独特的小标记之类的。
找着找着，突然发现目标基因的时候，那感觉就像是找到了宝藏一样，心里可美了。
接着就是获取这个基因啦。
这就好比把找到的宝藏小心翼翼地挖出来。
有好多种方法呢，像从生物的基因组里直接切出来，这个过程就像是用一把超级小的剪刀，精准地把想要的那部分基因剪下来。
或者用一些其他的巧妙手段，像是从mRNA反转录得到，就像是照着一个影子重新做出实体一样。
再之后就是把这个基因放到一个载体里。
载体就像是一个小飞船，要带着基因去一个新的地方。
这个过程可不能马虎，就像把宝贝小心翼翼地放进一个小盒子里，还得保证放得稳稳当当的。
而且这个载体还得是经过精心挑选的，就像给宝贝选一个最合适的运输工具。
然后就是把带着基因的载体送到宿主细胞里。
宿主细胞就像一个小房子，这个时候就像是把带着宝贝的小盒子送到一个新的家里。
这个送的过程也得很小心，要让载体顺利地进入细胞，不能把这个小房子给弄坏了。
等基因进入宿主细胞后呀，还得检查一下到底有没有成功呢。
这就像是检查宝贝有没有在新家里安顿好。
用一些特殊的方法，像是看基因有没有表达出特定的东西。
如果成功了，那就像一场精心策划的旅行完美收官，心里别提多开心了。
要是没成功呢，也别灰心，就像一次小冒险失败了，再重新来一次就好啦。
分子克隆就是这样一个充满挑战又特别有趣的过程，每一步都像是在微观世界里的一次奇妙探索呢。
分子克隆——主要步骤
笔记3（分子克隆2——重要步调）分子克隆可以分为以下几个步调：分别制备待克隆的DNA片断————将靶DNA片断与载体在体外进行衔接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选.判定阳性重组子————重组子的扩增.1.带有目标基因的DNA片断的获得：可以用限制内切酶降解基因组DNA,再合营应用其他试验手腕得到待定的DNA片断,可以用超速离心的办法分别出具有特定核苷酸构成的DNA片断,可以用mRNA做模板,用反转录酶合成互补DNA,即cDNA,也可以用化学合成的办法直接合成一段DNA.分子的构建：重组DNA分子中包含两部分,一部分是外源DNA,即目标DNA片断,另一部分是载体DNA.用作载体的,有质粒.噬菌体或病毒DNA.它们的根本特点是可以或许自力复制.假如用统一种限制性内切酶切割这两种DNA,则它们的末尾完整雷同,因为有互补的单链末尾序列消失,在衔接酶的感化下,就可以形成重组DNA分子.在没有互补单链末尾的情形下,也可以用酶学办法造成一个互补单链末尾之后再进行衔接.3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选：重组DNA分子必须进入宿主细胞中,才干得到扩增和表达．这个进程叫做转化.大肠杆菌是今朝应用最普遍的宿主细胞.除此以外．其他细菌.酵母.哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞,可以依据试验的须要加以选择.在被转化的宿主细胞中,不合的单个细胞(在平板上表示为单个菌落,亦称克隆)中可能含有不合的重组质粒或非重组质粒,是以必须进行筛选,以便肯定哪些是重组克隆.筛选可以应用抗菌素抗性或其他办法,依载体的性质而定.4.特定重组克隆的辨别：因为重组克隆往往是较多的,而在某一克隆试验中,我们感兴致的目标克隆只有一个或几个,所以须要进一步辨别.应用的办法重要有核酸杂交法和免疫化学法.此外,找出了目标克隆之后,还须要依据试验的目标,进一步弄清目标克隆中外源DNA片断上的基因的构造和功效.重要有酶切图谱的制订,基因在DNA片断上的准肯定位,肯定是否有内含子,DNA序列剖析,离体翻译试验,外源基因在某些宿主细胞中的表达及产品的提纯等.。
分子克隆实验步骤总结
分子克隆实验步骤总结分子克隆实验步骤1.对目的片段进行pcr扩增：Pcr体系：（50μL）DNA Template：10-100ng10×PCR buffer：5μL50mM dNTPs：0.5μLPrimers：1μM eachWater：add to 49μLTaq Polymerase：1μL2.琼脂糖电泳，看有无目的条带3.对目的条带进行切胶回收4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；Taq酶，则无需加尾）加尾体系：（10μL）胶回收DNA: 8μLBuffer: 1μLdNTPmix: 0.5μLTaq Polymerase：0.5μL5.T载体连接：室温，30min体系：（6μL）加尾后产物：4μLT载体：1μLSalt solution 1μL6.30-40μL感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）9. 加SOC（200-250μL）10.37℃，300rpm，1h11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜13.试剂盒提质粒14.酶切：37℃，2h体系：（20μL）Buffer2: 2μL酶：0.5μL模板：1μLBSA：0.2μLH2O：16.31μL15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。
菌落PCR体系（20ul）10*taq buf 2uldNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM）1.6ul Primer F （10uM）0.5ul Primer R（10uM）0.5ul DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul ddH2O 12.5ul程序：94度10min94度30sec56度30sec72度2:10 30cycle 72度10min4度forever。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆详细步骤
分子克隆详细步骤分子克隆是通过重组DNA分子来产生大量完全相同的DNA序列的技术。
在分子克隆工作中，我们主要进行克隆载体的构建、目标DNA的扩增、将目标DNA插入克隆载体中、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍这些步骤：1.克隆载体的构建：克隆载体是用于插入目标DNA的DNA分子。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
在构建克隆载体时，我们首先需要选择适合的载体，并提取载体的DNA。
然后，利用酶切酶对载体进行酶切，生成线性的载体DNA。
接下来，将目标DNA插入克隆载体的相应位点上，形成重组的载体。
2.目标DNA的扩增：目标DNA可以通过PCR（聚合酶链反应）来扩增。
首先，设计引物，使其与目标DNA的两端末端相互互补。
然后，在PCR反应中，通过DNA聚合酶的扩增作用，使目标DNA得以扩增。
PCR反应通常包括模板DNA、引物、核苷酸和聚合酶等成分。
3.目标DNA的插入：将扩增后的目标DNA与酶切后的载体进行连接，利用DNA连接酶催化目标DNA与载体之间的连接反应，生成重组的克隆载体。
连接后的载体含有目标DNA的序列。
4.转化：将克隆载体引入宿主细胞中进行复制。
这一步骤通常称为转化。
转化可以通过电击、热激、化学方法等方式进行。
宿主细胞通常是大肠杆菌等细菌。
5.筛选：利用筛选方法来选择包含目标DNA的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、报告基因筛选和限制性内切酶酶切筛选等。
抗生素筛选是将带有选择性抗生素耐受基因的克隆引入含有相应抗生素的培养基中，只有带有目标DNA的克隆才能生长。
报告基因筛选是通过将报告基因插入克隆载体中，使之与目标DNA一起被转录和翻译，从而表达报告基因的蛋白质，以此来筛选包含目标DNA的克隆。
限制性内切酶酶切筛选是通过限制性内切酶对重组载体和目标DNA进行酶切，并通过凝胶电泳的方法来分离并检测含有目标DNA的克隆。
以上就是分子克隆的详细步骤。
通过这些步骤，我们可以获得大量完全相同的DNA序列，并用于各类分子生物学研究和应用中。
分子克隆操作流程
3、 从 pMD18T-IgG 质粒中扩增 CH(IgG)片段
体系：
pyrobest taq
0.5ul
10* pyrobest taq buffer II
5ul
dNTP
4ul
pET32a_scAb_2P2F 质粒
0.5ul (0.1ng~10ng)
primer1:CH5L_120207
1ul
primer2: CH3_120207
条件 72℃反应 20min，冰上静置 1~2min 7、 连接 T 载体 pMD18-T vector 上述 A-Tailing DNA 溶液 ddH2O Solution I
0.5ul 5ul 4ul 补齐至 50ul（0.5~5ug）
1ul 4ul（0.1~0.3pmol） 0 5ul（等体积）
pyrobest taq 10* pyrobest taq buffer II dNTP VH 第一轮扩增片段 CH 第一轮扩增片段 primer1:VH5_1_120207 primer2: CH3_120207 ddH2O
0.5ul 5ul 4ul 0.5ul (50ng) 0.5ul (50ng) 1ul 1ul up to 50ul (38ul)
end
3、 提阳性克隆质粒
4、 酶切鉴定阳性克隆质粒是否为假阳性（选做）
体系：
酶 1 and 酶 2
各 0.5ul
10* Buffer N（参照说明书选择合适 buffer） 2ul
100*BSA
0.2ul
阳性克隆质粒
5ul(1ug)
ddH2O
up to 20ul
条件： 37℃ 2~4hr
1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切成功与否，同样看未酶切与酶切跑得快慢，以及切下片段 大小。 上样情况： Marker 未酶切质粒 酶切质粒
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分子克隆一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的量，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10*buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。
（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。
1ul量太少，可以加将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。
6ul 15000bp的maker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。
可对比maker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于连接反应的用量。
Image J软件可以做灰度分析。
）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。
回收完之后用同样的方法分析其浓度。
（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。
）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16°连接12-16h。
载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3~1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。
扫胶的电脑上有个文件：连接反应.xls，按要求填写即可得出连接反应的用量。
因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。
如果时间比较紧张，可以25°连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul 16°继续连接。
三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70°中取出感受态，在手心融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，混匀。
冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。
然后立即插入冰上，静置2min。
（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。
）在超净台中加入700ul LB培养基，然后37°摇床培养45min-1h；4000rpm离心3min，在超净台中弃去700ul上清，然后轻轻吹打残留的菌液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精灯上烧热灭菌，后冷却）37°培养箱先正放15min，之后倒置培养12-16h。
（超过16h，则阳性克隆周围会生出卫星菌落，原因是阳性克隆会分泌水解氨苄的酶到培养基中，水解其周围的氨苄，因此，平板上的DH5α、杂菌等会生长。
）四、重组子的挑取培养挑选单克隆到2ml LA培养基中，37°培养8-16h，可提质粒。
（要在管壁上部用注射器的针头烧热，戳个小洞，因为大肠杆菌是好氧的，无菌会生长缓慢）其实在挑克隆培养的时候就可以PCR鉴定，先配好PCR反应体系，在超净台中，同一个克隆，一半用于摇菌培养，一半用小的枪头挑取在对应的PCR体系里涮一下，即可作为模版进行PCR反应。
PCR时要做阴性、阳性对照；阴性对照，用枪头在没有菌落的培养基上沾一下做模版（PCR灵敏度很高，要排除连接体系中的残留的DNA对结果影响的可能），阳性对照用最初PCR扩增DNA片段时的模版。
也可以等37°培养8-16h之后取1ul菌液做模版鉴定，或者提质粒之后，用质粒做模版进行鉴定，均可。
五、质粒的提取与电泳检测1.在超净台中取300ul菌液与无菌EP管中，4°保存，待鉴定是否成功后取100ul菌液+100ul 50%甘油保种，送200ul菌液到公司测序，不正确的丢掉即可。
（如果质粒量很多，也可以送5-10ul质粒测序）2.取1ml菌液到新的EP管, 12000 rpm离心30s，弃上清，再将700ul剩余菌液于同一EP管，12000 rpm离心30s，弃上清。
然后瞬时离心，将残留液体吸干。
（枪头不能重复使用）3.加入预冷的100µl 溶液I。
反复吹打混匀。
（一定要混匀，不然会影响裂解效果，可以用涡旋混合器震荡混匀）4.加入200µl溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次。
（不要剧烈震荡，防止基因组DNA、质粒断裂，可以悬空加试剂，这样不用换枪头，而且比较快，下同）5.观察到溶液变清后，立即加入预冷的150µl 溶液III。
颠倒3-5次，颠倒时用手指轻弹离心管底部，混匀。
冰浴5min。
12000rpm离心10min。
6.取400ul上清至另一干净的离心管中（尽量不要吸到白色的沉淀物质，如果效果不理想，可以转移400ul上清至新离心管，12000rpm，5min，之后在转移上清），加入280µl异丙醇，充分混匀。
室温放置2min，12000rpm离心10min。
7.弃上清，加入1ml 75%的乙醇，轻轻颠倒两次，12000rpm离心5min。
8.弃上清，然后瞬时离心，用Tip头将残留酒精吸干。
空气中干燥10min。
9.加入25ul 含有RNA酶的ddw溶解质粒。
（RNA酶溶液：取10ul RNA酶，加990ul ddw）10.取1ul质粒，加9ul ddw，2ul 6*loading buffer，混匀电泳检测质粒浓度。
六、酶切鉴定或者PCR检测大约酶切1ug质粒进行鉴定。
如果质粒含量太少，即便能够切下目的条带，也有可能看不到。
（为了节约，鉴定时取0.25-0.5ul的酶，20ul体系，酶切30min-1h，即可电泳跑胶）PCR检测，则将提取的质粒稀释10-100倍到适合做模版的浓度（taq酶的说明书上有说明），利用目的片段的引物，使用普通的taq酶PCR即可。
注意事项：1.移液器使用结束后调回最大量程放归远处。
2.本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。
3.不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。
而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。
取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。
4.Ep管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。
5.制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。
制胶时要除去气泡。
拔梳子时要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。
6.上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。
也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
7.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害，对眼睛尤甚。
观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜或眼罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。
割胶回收动作要快，避免紫外照射时间过长，使得DNA突变。
8.实验中注意更换枪头，以避免试剂的污染，悬空滴加试剂的话，可以连续使用。
碱裂解法质粒提取的原理溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。