分子克隆技术步骤
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
分子克隆技术步骤[整理]
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分子克隆技术步骤在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。
常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。
将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。
cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。
每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。
特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。
cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。
1.方法：(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。
(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。
在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。
质粒DNA可通过转化引入寄主菌。
在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆实验步骤总结
分子克隆实验步骤总结分子克隆实验步骤1.对目的片段进行pcr扩增：Pcr体系：（50μL）DNA Template：10-100ng10×PCR buffer：5μL50mM dNTPs：0.5μLPrimers：1μM eachWater：add to 49μLTaq Polymerase：1μL2.琼脂糖电泳，看有无目的条带3.对目的条带进行切胶回收4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；Taq酶，则无需加尾）加尾体系：（10μL）胶回收DNA: 8μLBuffer: 1μLdNTPmix: 0.5μLTaq Polymerase：0.5μL5.T载体连接：室温，30min体系：（6μL）加尾后产物：4μLT载体：1μLSalt solution 1μL6.30-40μL感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）9. 加SOC（200-250μL）10.37℃，300rpm，1h11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜13.试剂盒提质粒14.酶切：37℃，2h体系：（20μL）Buffer2: 2μL酶：0.5μL模板：1μLBSA：0.2μLH2O：16.31μL15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。
菌落PCR体系（20ul）10*taq buf 2uldNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM）1.6ul Primer F （10uM）0.5ul Primer R（10uM）0.5ul DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul ddH2O 12.5ul程序：94度10min94度30sec56度30sec72度2:10 30cycle 72度10min4度forever。
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分子克隆技术步骤在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。
常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖( 细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。
将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA 克隆两类。
cDNA 克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。
每一cDNA 反映一种mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。
特点是：①有些生物，如RNA 病毒没有DNA ，只能用cDNA 克隆；②cDNA 克隆易筛选，因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息；③cDNA 能在细菌中表达。
cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。
1. 方法：(1) DNA 片段的制备：常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段；②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。
(2) 载体DNA 的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。
在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。
质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。
在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。
此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。
质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。
②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。
中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。
λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。
M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。
M13DNA(RF) 在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。
寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体，又能方便地制备单链DNA ，用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。
③拷斯(Cos) 质粒：是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。
是噬菌体－质粒混合物。
此类载体分子容量大，可携带45kb 的外源DNA 片段。
也能象一般质粒一样携带小片段DNA ，直接转化寄主菌。
这类载体常被用来构建高等生物基因文库。
(3) DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。
在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。
②平头末端连接，用物理方法制备的DNA 往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。
平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。
④人工接头分子连接，在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。
连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。
以λ或Cos 质粒为载体时，形成线性多连体DNA 分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。
以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。
(4) 引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA 被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA 低，原因是连接效率不高，有许多DNA 分子无转化能力，而且重组后的DNA 分子比原载体DNA 分子大，转化困难。
② 转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。
(5) 克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。
例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA 片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。
②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA 插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。
如一质粒有A 和B 两个抗药性基因，当外源基因插入到B 基因区后，便只抗A 药而不抗B 药。
因此能在A 药培养基上正常生长而不能在B 药培养上生长的便是重组分子。
③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA 顺序的克隆。
方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。
阳性点的位置就是所需要的克隆。
④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。
2. 重要意义与应用：分子克隆技术是70 年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。
它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。
在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。
还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。
在基因治疗方面。
通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40 病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。
为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。
在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。
许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。
在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。
在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。
在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。
有许多外源基因导入植物获得成功。
分子克隆——主要步骤（1）带有目的基因的DNA片段的获得（2）重组DNA分子的构建（3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选（4）特定重组克隆的鉴别可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。
2. 重组DNA分子的构建：重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。
用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。
它们的基本特征是能够独立复制。
如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA分子。
在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。
3. 重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选：重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。
大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。
除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。
在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞（在平板上表现为单个菌落，亦称克隆）中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。
筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。
4. 特定重组克隆的鉴别：由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进步鉴别。
使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。
此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。
主要有酶切图谱的制定，基因在DNA片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。
分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接胞————筛重组DNA分子转入宿主细选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。
分子克隆方法DNA 片段的制备常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段；② 用物理方法(如超声波)取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。
载体DNA 的选择①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。
在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。
质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。
在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。
此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。
质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。
②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。
中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。