分子克隆
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
生物中的分子克隆
生物中的分子克隆克隆是指复制一个已经存在的个体或物品，分子克隆则是指复制分子。
在生物领域中，分子克隆技术极其重要，它能够让科学家们克隆出特定的蛋白质、基因和细胞等分子，不仅推动了基因工程、生物制药等领域的发展，还有助于对医学、生态学、进化论等问题的深入研究。
一、DNA的分子克隆DNA双链分子由四种核苷酸组成，克隆某个特定的DNA序列，需要寻找到该序列的特异性序列，一般采用如下方法：1.限制性内切酶切割法：将要克隆的DNA进行限制性内切酶切割，将切割后的DNA片段进行电泳分离，并用紫外线照射，使用UV灯观察DNA条带，选取符合要求的目标DNA条带作为模板，再使用电泳提取出目标DNA条带，进行下一步的操作。
2.基因库方法：将DNA切成片段后，将这些片段以随机顺序插入载体中，再将这些载体插入到宿主细胞中，寻找到目标片段所在的载体后，就可以从中将这个片段克隆出来。
通过上述方法，克隆出目标DNA后，还需要定位、测序、分析等步骤，才能够达到所需的效果。
二、基因的分子克隆基因是细胞中负责遗传物质传递的重要分子，克隆基因是基因工程活动中的一个重要环节。
1.针对已有的已知基因，可以使用上述DNA分子的克隆方法，将基因克隆出来，进行重组、改变等操作。
2.针对未知的基因，可以进行基因组测序与分析，利用反向遗传学法进行基因定位及功能分析。
3.对于人类常见疾病，例如乳腺癌、某些遗传性疾病等，深入研究它们的基因表达和调控，利用分子克隆技术进行基因治疗或转基因实验。
基因的克隆不仅促进了对于遗传学和基因学的深入研究，也能够产生特定的应用效果，甚至应用到生物治疗和治疗遗传性疾病等医学领域。
三、细胞的分子克隆细胞是生命活动的基本单位，克隆细胞可以使得相似的细胞在体外大量生长，提供研究的可操作性。
目前，主要有两种方法可以利用分子克隆技术克隆细胞：1.体外培养法：通过细胞培养基、激素等营养物质及生长因子，为细胞提供生长环境，使其在体外快速繁殖，而体外克隆细胞最广泛应用的领域就是生物制药，例如克隆出产生特殊蛋白质的细胞系，生产生物药品。
分子克隆
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第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
3
第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
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第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
1
第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
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第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
分子克隆操作方法
分子克隆操作方法
分子克隆是一项常用的生物技术，用于将特定DNA 片段定向克隆到载体DNA 上，生成包含目的基因的重组DNA 分子。
以下是分子克隆的常用方法：
1. 限制酶切剪接：利用限制酶切剪配对的方式，将目的DNA 片段和载体DNA 上的相应区域进行切割，得到两个切口，然后将两个断裂的DNA 片段连接起来，形成含有目标DNA 片段的重组DNA 分子。
2. PCR 扩增：利用PCR 技术对目的DNA 片段进行扩增，并将其与载体DNA 进行连接，形成重组DNA 分子。
3. TA 克隆：TA 克隆是一种优化的克隆方法，使用缺十二碳酸二酯酶的Taq DNA 聚合酶进行PCR 扩增，将目的DNA 片段amplified 插入含有单一胞嘧啶（T）的TA 克隆载体上，然后将TA 克隆载体转化到大肠杆菌中进行筛选。
4. 原位杂交：将互补的DNA 探针标记并与目的细胞DNA 结合，发现目的DNA 片段的位置，然后将其在载体上克隆。
5. 基因文库筛选：将目的DNA 片段插入到原核或真核生物基因文库中，然后筛选出含有目的DNA 片段的重组DNA 分子。
6. 自主克隆：将目的DNA 片段插入到自主复制的质粒上，使其复制并表达出
目的蛋白质。
需要根据具体实验目的，选择适合的方法进行分子克隆，为后续的分子生物学研究提供可靠的材料基础。
分子克隆
分子克隆
基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因 （外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体 外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质 粒）转入大肠杆菌体内这样重组质粒就随大肠杆菌 的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多 肽或蛋白质。
质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够
分子克隆的实验流程操作
PCR扩增目的基因 双酶切 （PCR产物， 质粒）（切） 电泳 切胶 回收
柱式纯化
菌落 转化 PCR （转，增）
连接反应 （接） 挑选阳 电泳 性菌测 序（检）
分子克隆流程示意图 质粒 抽提
（PCR扩增）
将验证反馈的 菌株保存起来
测序验证
菌落PCR
1 实验操作目的DNA片段的来源
以免穿破凝胶的底部缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到 孔外。
（5）打开电源120V，30min。
4 切胶回收
1，加3倍凝胶体积Buffer DE-A温浴75℃融化凝胶 2，加含0.5个Buffer DEA体积的Buffer DE-B
5，加入一定量 的d2H2O洗脱 3，加500 μl Buffer W1 4，加700 μl Buffer W2 加700 μl Buffer W2
1，超净工作台紫外灯10分钟。
2，把感受态细胞从-80℃的冰箱中取出放在已砸碎的冰块中5分钟。
3，取重组质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打，混匀。 4，冰浴放置30分钟。 5，再在水浴中42℃热激一般90秒钟后，再在冰中放置3分钟。 6，在超净工作台中向上述各管中分别加入1ml LB培养基（不含氨苄） 轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。 7，离心，5000rpm 1min吸取1ml上清液 8，把剩余感受态细胞涂布到含氨苄青霉素培养基上，将平板在37℃培 养箱倒置培养过夜。因为载体中含有氨苄青霉素的耐药基因，只有含质 粒的细菌能够生存，而不含质粒的细菌则死亡。
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3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
此酶具有以下特点：
①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增 长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Molecule of the year)
TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应
(polymerase chain reaction，PCR)中， 能以DNA为模板，从结合在模板上的引物 出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式， 从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA 聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活 性，随着温度的降低，酶活性明显下降。 同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无 校正功能。
（1）. 使核酸降解的核酸酶类：
核酸内切酶、核酸外切酶。
（2）.催化核酸合成的酶类：
DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。
是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解 核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌 体内，这种内切酶可以分解外源性的 DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的 DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基 化所保护。
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
目的DNA （target fragment）
DNA 重组
重组DNA （recombinant DNA ） 转化
筛选、扩增 宿主（host） 克隆（clone）
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接
转—重组DNA导入宿主细胞
筛—重组DNA的筛选与鉴定
用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速 生长的细胞，从而获得感受态细胞。 ②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的 羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。
（二）DNA进入细胞： ③.通过热激作用促进细胞对DNA 的吸收。 ④.然后将细胞接种于含相应抗生 素的培养基上，含有重组子的感受 态细菌将形成单菌落。 ⑤. 挑选单菌落进行相应的筛选及 鉴定分析。
DNA限制性内切酶
DNA连接酶 100μl
4.目的基因的分离与制备 ⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因
5.目的基因的体外重组
DNA分子的体外重组:是DNA分 子之间的连接过程。这是一个DNA 连接酶催化的生物化学反应 。
6.重组子导入宿主细胞
体外重组生成的重组子必须导入到
2.PCR反应过程：
①94℃变性
20-40个 PCR循环 循环
1个PCR
② 50-65℃退火
③72℃延伸
5’ 3’
引物
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理
①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 3.PCR基本要素 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、 dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂
分子克隆
（一）基本概念:
• 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。
• 分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分 子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分 子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获 得新得遗传特征的过程。
PCR扩增
转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 型
转染：以病毒作载体构建的重组பைடு நூலகம் 导入受体细胞的过程 转导：以噬菌体作载体构建的重组 体导入受体细胞的过程
重组DNA的筛选与鉴定方法 平板筛选（插入失活、蓝白筛选）
1
2 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
2.分子克隆中常用工具酶：
pEGFP-N2-PPARγ
pGL4-PPRE4-luc
PGL4-luc载体片段 pEGFP-N2载 体片段 PPARγ基因 片段 PPRE4基因片段
接种
菌液
7.阳性重组子的筛选和鉴定
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因， 常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗 四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因 (Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体 的位点在抗药性基因之外，不导致抗药 性基因的插入失活，仍能编码抗药性基 因，这种含有重组子的转化细胞能够在 含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。
合适的宿主细胞中才能进行复制、 扩增和表达。 宿主细胞分为两种：原核细胞和真 核细胞。
⑴感受态细胞(competent
cell): 系指利用理化的方法人工诱导 细菌，使之处于易于吸收和容纳外 源DNA分子的状态，这时的细胞就 称为感受态细胞。
⑵转化过程：
①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即
催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸
和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶， 称为DNA连接酶(DNA ligase)。 DNA连接酶主要有两种： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶
3.基因克隆常用载体
目前用于基因克隆的载体种类繁多，
包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌 体载体、酵母菌质粒载体以及动、植 物病毒载体等