分子克隆技术讲解课件
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植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
28
Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
19
质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
37
⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
分子克隆课件
分子克隆目录（一）.基本概念 (2)1.分子克隆： (2)2. Dalton，bp，nt (2)3.保护碱基 (2)4.T-A克隆： (2)5.RNA酶H活性： (2)6.载体： (2)7.质粒(plasmid) (2)8. F因子 (3)9. 位点偏爱（Site preference） (3)10.星星活性： (3)（二）分子克隆的基本过程 (3)1.概述 (3)2.分子克隆中常用工具酶 (3)3.基因克隆常用载体 (7)4.目的基因的分离与制备 (11)5.目的基因的体外重组 (11)6.重组子导入宿主细胞 (12)7.阳性重组子的筛选和鉴定 (13)（三）.单链丝状噬菌体 (14)1.M13 噬菌体的生物学 (14)2. M13 噬菌体载体 (17)3. M13 噬菌体载体的宿主菌 (18)4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 (17)5. 噬菌粒 (11)6. M13KO7 辅助噬菌体 (12)（一）.基本概念1.分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。
2. Dalton，bp，nt道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。
碱基对（bp）＝base pair，1 kb就是1000个碱基对；nt＝核苷酸nucleotide 。
3.保护碱基在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
4.T-A克隆：利用Taq酶在PCR产物3‘末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR 产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3’末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。
第八章 分子克隆技术
质粒的命名： 质粒的命名：
用小写字母p代表质粒（ ），在 字 用小写字母 代表质粒（plasmid），在p字 代表质粒 ）， 母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者 或实验室名称，再加上质粒编号。 或实验室名称，再加上质粒编号。 表示一种质粒， 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR” ： 表示一种质粒 则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. 则是分别取自该质粒的两位主要构建者 Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 为编号。 和 ， 为编号
•
对双链DNA同时切割，产生不同形式的切 同时切割， 对双链 同时切割 口: 1）形成平头末端（ blunting ends） ）形成平头末端（ ） 2）形成5ˊ 粘性末端（Cohesive ends） ）形成 ˊ 粘性末端（ 3）形成3ˊ粘性末端 ）形成 ˊ
平Байду номын сангаас端
5ˊ粘性末端 ˊ
3ˊ粘性末端 ˊ
载体的基本特征： 载体的基本特征：
• 在宿主细胞中能够自主复制； 在宿主细胞中能够自主复制； • 具有多种限制酶的单一识别序列（多克隆位点）， 具有多种限制酶的单一识别序列（多克隆位点）， 以供外源基因插入； 以供外源基因插入； • 多克隆位点位于不影响复制的非必需区域，插在其 多克隆位点位于不影响复制的非必需区域， 的靶基因片段能被动跟着载体一起复制； 中 的靶基因片段能被动跟着载体一起复制； • 携带易于筛选的选择标记； 携带易于筛选的选择标记； • 容易从宿主细胞中分离纯化； 容易从宿主细胞中分离纯化； • 使用安全
质粒在寄主细胞中的作用: 质粒在寄主细胞中的作用: “友好”地“借居”在宿主细胞中，既不杀 友好” 借居”在宿主细胞中， 死细胞，对宿主的代谢活动也无影响； 死细胞，对宿主的代谢活动也无影响； 借助本身带进去的基因在细胞中表达其遗传 信息， 信息，编码一些重要的非染色体控制的遗传性 为宿主执行一些适当的遗传功能。 状，为宿主执行一些适当的遗传功能。如对抗 菌素的抗性，对重金属的抗性等。 菌素的抗性，对重金属的抗性等。
《分子克隆实验设计》PPT课件
二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
18
测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
6
质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
11
转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
16
酶切电泳筛选(*)
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
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测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
6
质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
11
转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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酶切电泳筛选(*)
《克隆技术》课件PPT课件
克隆技术在濒危物种保护中的应用前景
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胚胎细胞克隆
总结词：将供体细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，经过培养和激活后形成胚胎并进行移植。 详细描述：核移植克隆是一种利用细胞核移植技术进行无性繁殖的方法。首先，从供体动物体内取出细胞核，然后将其移植到去核的卵母细胞中。经过培养和激活后，形成胚胎并进行移植，最终产生遗传上与原个体完全相同的新个体。 科学依据：核移植克隆技术基于细胞核的全能性和卵母细胞的去分化能力，通过精确的操作实现克隆过程。 技术应用：核移植克隆技术已被应用于多种动物克隆，如牛、羊、猪等。同时，该技术也被应用于人类胚胎干细胞的体外培养和生产。
04
克隆技术的未来发展
克隆技术的科研进展
科研进展
科学家们正在不断探索克隆技术的科研进展，包括对克隆技术的原理、技术手段和伦理问题等方面进行深入研究。
科研成果
随着科研的深入，克隆技术已经取得了一些重要的科研成果，例如成功克隆出人类胚胎干细胞、治疗性克隆技术的发展等。
科研挑战
尽管克隆技术取得了一些进展，但仍面临着许多挑战，例如技术难度大、伦理和法律问题等。
克隆技术在农业领域的应用前景
保护优势
克隆技术可以为濒危物种保护提供更为有效和可靠的方式，避免物种灭绝的风险。
保护挑战
然而，克隆技术在濒危物种保护中的应用仍面临着一些挑战，例如技术难度大、伦理和法律问题等。
濒危物种保护
克隆技术也可以应用于濒危物种的保护，例如通过克隆技术繁殖濒危动物，保护其种群数量。
核移植克隆
成年动物体细胞克隆
总结词：利用成年动物的体细胞进行核移植，形成胚胎并进行移植，产生遗传上与原个体完全相同的新个体。
ligation independent cloning-分子克隆技术ppt课件
【参考】NusA技术：显著增强大肠杆菌表达可溶、活性蛋白：/experiment/430/465/;2BT Ecoli T7 ColE1-ori LICv1 transfer His6-tev-yORF AMP （全长4876bp）
NUSA标签
NusA融合蛋白表达系统于1999年由Davis发明，并在2000年由Novagen首先进 行商业化设计和开发，特别推荐用于以NusA作为N端标签时提高在大肠杆菌中难 溶的重组表达蛋白的可溶性。
已有充分的证据证明NusA标签系统能显著提高多种不同来源蛋白的可溶性表达， 而这些蛋白在单独表达时往往形成不可溶的包涵体。在一些研究报告中，用蛋白 酶切除NusA标签能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性；相反，在另外许多 报道中也指出当目的蛋白与NusA融合而非切除时，融合蛋白也同样具有活性。 NusA标签系统的成功至少部分地是由于其与大肠杆菌分子伴侣系统相互作用的结 果。
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的 不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不 仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且 操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广 泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特
Vector
Tag
2BT 2CT 2GT 2NT 2ST
His6-tev-yORF His6-MBP-N10-tev-yORF His6-GST-tev-yORF His6-NusA-tev-yORF His6-Sumo-tev-yORF
Expression Host
E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7
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4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
克 隆 示 意 图
克隆示意图
1. 用限制性酶消化 DNA 样品
粘性末端
2.用 限制 性内 切酶 消化 质粒
DNA
3.连接样品DNA和质粒DNA的 消化产物
冷循环器
4.用连接产物转化大肠杆菌感 受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以
促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进
DNA 吸收。
用氯化钙化学转化
用氯化钙化学转化
电激转化
一个电激转化程序
加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细 菌中
将混合物放入一个预冷的电激杯中 施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8
to 12ms 立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡
含有CAP （代谢物活化蛋白）结合位点, 启动子Plac, lac 阻遏蛋白结合位点 编码beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的 lacZ基因的5‘端(来自 M13mp18/19).。这个多肽片段的 合成可受IPTG诱导， 与突变菌(mutation lacZDM15)实 现 alfa互补。
pUC18和 pUC19
pBR322
pBR322
pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化时， 它便从该质粒获得了抗 生素抗性。两个抗生素 基因中均含供插入外源 DNA用的不同的单一酶切 位点。一般只选一个抗 生素基因作为插入外源 DNA之用。外源DNA插入 后该抗生素抗性失活。 另一抗生素抗性基因则 作为转化细菌后筛选阳 性克隆之用。
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
2-4 小时。 分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有 抗菌素的LB 琼脂平板上， 保温培养1天。
5. 细菌在加有Amp+X-Gal的培 养基上生长以进行筛选
连接会有三种结果，一是要插入的序 列自连；二是切开的质粒重连；三是 要插入的序列与质粒相连。第一种连 接结果没有菌落形成。第二种连接结 果表现为蓝色菌落。只有后一种结果 是符合需要的，产生白色的抗氨苄青 霉素菌落。
植保生物技术讲座05
第五讲 分子克隆技术
克隆载体
是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的 序列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点：
1. 启动自发复制的能力.
2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。
3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA
4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片段。
阻遏蛋白结合位点和 lacZ基因的 5’-端 序列(lacZ基因的第6-7个密码子被多克隆
位点取代)。
M13mp18/19结构图
多克隆位点
Lambda噬菌体
Lambda噬菌体是一种大肠杆菌的温和性噬菌体。 其 DNA 是线状的、双链的 (48502 nt)，两端的 5’-端有12 个碱基是单链的，碱基互补的。噬 菌体DNA注射到菌体内后末端碱基互补而环化。 在裂菌循环途径，噬菌体编码复制、溶菌和衣 壳蛋白的基因表达。噬菌体DNA复制，复制品 被切下来，包装到子代噬菌体粒体中。在溶原 循环中，噬菌体基因的表达受到遏制，其DNA 通过重组插入到细菌染色体中。
四个重要位点
(1) 负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
灭 菌 器
加IPTG和X-GAL
倒平板
划 线
筛选结果
蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表 达出由完好的α LacZ序列编码的功能 性的 α 片段
白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉 素菌，质粒上α LacZ序列上有插入片 段重 组 Nhomakorabea体 筛 选
筛选结果模式图
蓝 菌 落
蓝菌落
蓝 白 菌 落
蓝白菌落
蓝白菌落
乳糖和诱导物IPTG的化学结构
isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
X-gal
X-gal水解
实验室
实验室
移液枪
不同规格的小离心管
2ml
1.5ml
0.5ml
吸 取
使用移液枪
使 用 移 液 枪
电泳仪
(1) f1 (IG) –噬菌体 f1的基因间区; (2) rep (pMB1) –pMB1 的复制子，负责 质粒的复制； (3) bla (ApR) –编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨 苄青霉素的抗性; (4) lacZ基因的 5’端 序列，编码编码beta-半乳糖苷酶 的N-端多肽，有了这个这个多肽片 段，就可以菌落蓝白反应对重组质 粒进行筛选
pBluescript II KS/SK
pBluescript SK
M13mp18 和 M13mp19 载体
单链、雄性专化的DNA丝状M13的衍生 物。两个载体均为 7250 bp 长，其多克隆 位点方向相反 。 在 E.coli 操作元 lac 区 含 CAP 蛋白结合位点、 启动子 Plac、lac
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
克 隆 示 意 图
克隆示意图
1. 用限制性酶消化 DNA 样品
粘性末端
2.用 限制 性内 切酶 消化 质粒
DNA
3.连接样品DNA和质粒DNA的 消化产物
冷循环器
4.用连接产物转化大肠杆菌感 受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以
促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进
DNA 吸收。
用氯化钙化学转化
用氯化钙化学转化
电激转化
一个电激转化程序
加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细 菌中
将混合物放入一个预冷的电激杯中 施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8
to 12ms 立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡
含有CAP （代谢物活化蛋白）结合位点, 启动子Plac, lac 阻遏蛋白结合位点 编码beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的 lacZ基因的5‘端(来自 M13mp18/19).。这个多肽片段的 合成可受IPTG诱导， 与突变菌(mutation lacZDM15)实 现 alfa互补。
pUC18和 pUC19
pBR322
pBR322
pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化时， 它便从该质粒获得了抗 生素抗性。两个抗生素 基因中均含供插入外源 DNA用的不同的单一酶切 位点。一般只选一个抗 生素基因作为插入外源 DNA之用。外源DNA插入 后该抗生素抗性失活。 另一抗生素抗性基因则 作为转化细菌后筛选阳 性克隆之用。
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
2-4 小时。 分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有 抗菌素的LB 琼脂平板上， 保温培养1天。
5. 细菌在加有Amp+X-Gal的培 养基上生长以进行筛选
连接会有三种结果，一是要插入的序 列自连；二是切开的质粒重连；三是 要插入的序列与质粒相连。第一种连 接结果没有菌落形成。第二种连接结 果表现为蓝色菌落。只有后一种结果 是符合需要的，产生白色的抗氨苄青 霉素菌落。
植保生物技术讲座05
第五讲 分子克隆技术
克隆载体
是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的 序列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点：
1. 启动自发复制的能力.
2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。
3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA
4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片段。
阻遏蛋白结合位点和 lacZ基因的 5’-端 序列(lacZ基因的第6-7个密码子被多克隆
位点取代)。
M13mp18/19结构图
多克隆位点
Lambda噬菌体
Lambda噬菌体是一种大肠杆菌的温和性噬菌体。 其 DNA 是线状的、双链的 (48502 nt)，两端的 5’-端有12 个碱基是单链的，碱基互补的。噬 菌体DNA注射到菌体内后末端碱基互补而环化。 在裂菌循环途径，噬菌体编码复制、溶菌和衣 壳蛋白的基因表达。噬菌体DNA复制，复制品 被切下来，包装到子代噬菌体粒体中。在溶原 循环中，噬菌体基因的表达受到遏制，其DNA 通过重组插入到细菌染色体中。
四个重要位点
(1) 负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
灭 菌 器
加IPTG和X-GAL
倒平板
划 线
筛选结果
蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表 达出由完好的α LacZ序列编码的功能 性的 α 片段
白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉 素菌，质粒上α LacZ序列上有插入片 段重 组 Nhomakorabea体 筛 选
筛选结果模式图
蓝 菌 落
蓝菌落
蓝 白 菌 落
蓝白菌落
蓝白菌落
乳糖和诱导物IPTG的化学结构
isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
X-gal
X-gal水解
实验室
实验室
移液枪
不同规格的小离心管
2ml
1.5ml
0.5ml
吸 取
使用移液枪
使 用 移 液 枪
电泳仪
(1) f1 (IG) –噬菌体 f1的基因间区; (2) rep (pMB1) –pMB1 的复制子，负责 质粒的复制； (3) bla (ApR) –编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨 苄青霉素的抗性; (4) lacZ基因的 5’端 序列，编码编码beta-半乳糖苷酶 的N-端多肽，有了这个这个多肽片 段，就可以菌落蓝白反应对重组质 粒进行筛选
pBluescript II KS/SK
pBluescript SK
M13mp18 和 M13mp19 载体
单链、雄性专化的DNA丝状M13的衍生 物。两个载体均为 7250 bp 长，其多克隆 位点方向相反 。 在 E.coli 操作元 lac 区 含 CAP 蛋白结合位点、 启动子 Plac、lac
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点