分子克隆实验
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
分子克隆 实验指南 第三版
分子克隆实验指南第三版
引言部分可以简要介绍分子克隆的概念、重要性和基本原理。
实验准备部分可以列出所需的主要仪器、试剂、菌种等,并对一些关键材料的选择和存储给出注意事项。
实验步骤部分可以按照顺序介绍主要的实验过程,如制备质粒载体、制备靶向DNA片段、连接反应、转化感受态细胞、笛卡尔计数和克隆笼选等。
对于每个步骤,可以概括说明原理和关键点。
实验注意事项部分可以总结一些可能遇到的常见问题及其对策建议。
可以介绍分子克隆技术的一些发展趋势和应用前景。
以上只是一个大致框架,具体内容需要根据版本定位和编写者的实际要求来决定。
无论如何,我都会避免直接引用任何可能构成版权侵权的内容。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法I一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。
无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；(2) 高速离心去杂质。
10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；(3) 核酸吸附。
往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4) 低速离心沉淀。
5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体；(5) 75%乙醇清洗。
加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。
重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；(6) 核酸洗脱。
加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。
方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min。
(2) 氯仿抽提。
10,000rpm离心3min，取约600ul上清。
加入1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心管架上晾干5min。
(5) 溶解DNA。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
分子克隆 实验指南 第三版
分子克隆实验指南第三版
《分子克隆实验指南第三版》是一本专门介绍分子克隆技术的实验手册。
分子克隆是现代分子生物学研究中一种非常重要的技术,广泛应用于基因工程、蛋白质工程、基因组学和转基因生物等领域。
该书主要包括以下几个方面的内容:
1. 分子克隆的基本原理和概念
2. 分子克隆常用的实验材料和试剂配制
3. 核酸(DNA和RNA)的提取和纯化方法
4. 限制性内切酶的使用
5. 质粒载体的选择和构建
6. 基因的克隆和重组
7. 克隆产物的检测和鉴定
8. 基因的表达和蛋白质的纯化
该书以实用性为主,提供了大量详细的实验步骤和注意事项,适合分子生物学和基因工程等相关专业的学生和科研工作者使用。
我尽量概括介绍了该书的主要内容,但没有复制或引用任何版权内容。
如果需要更多详细信息,可以查阅该书的正式出版物。
分子克隆部分实验报告
一、实验目的1. 学习分子克隆的基本原理和方法；2. 掌握质粒的提取、纯化、线性化及目的基因的插入等实验操作；3. 熟悉DNA的纯化、鉴定及重组载体的构建等实验技术。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因片段从基因组DNA中分离出来，并在宿主细胞中复制和扩增的过程。
实验过程中，利用限制性内切酶切割目的基因和载体，通过连接酶将二者连接形成重组载体，然后转化宿主细胞，筛选出含有目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pET-28a2. 目的基因：EGFP3. 限制性内切酶：BamHI、EcoRI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA分子量标准：DL20006. DNA纯化试剂盒7. 转化宿主细胞：大肠杆菌DH5α8. LB培养基、氨苄青霉素9. 等等四、实验步骤1. 质粒提取与纯化（1）按照试剂盒说明书提取质粒DNA；（2）用DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA；（3）检测质粒浓度和纯度。
2. 目的基因的线性化（1）用BamHI和EcoRI双酶切目的基因片段和载体；（2）用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物；（3）检测酶切产物浓度和纯度。
3. DNA连接（1）将纯化的目的基因片段和载体进行连接反应；（2）将连接产物转化大肠杆菌DH5α；（3）在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养转化菌。
4. 阳性克隆的筛选（1）提取转化菌的DNA；（2）用BamHI和EcoRI双酶切提取的DNA；（3）电泳检测酶切产物，筛选出与预期大小相符的重组质粒；（4）将重组质粒进行测序验证。
五、实验结果与分析1. 质粒提取与纯化：质粒浓度约为50ng/μl，纯度大于0.8。
2. 目的基因的线性化：酶切产物浓度约为10ng/μl，纯度大于0.8。
3. DNA连接：转化菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长良好。
4. 阳性克隆的筛选：电泳结果显示，重组质粒大小与预期相符。
5. 重组质粒测序验证：测序结果与预期序列一致，表明目的基因已成功插入载体。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子克隆技术实验报告姓名：班级：学号：指导老师：pUC19外源1.5kbDNA片段亚克隆于pUC1301摘要：分别从大肠杆菌菌液中提取质粒pUC19和pUC1301，两种质粒都使用Bam HI+Kpn I两种限制性内切酶进行切割。
回收pUC1301质粒中1.5kb片段，使用连接酶将它与切开的pUC19连接，转化感受态大肠杆菌，利用标记基因amp r、kan r和α—互补筛选阳性克隆。
实验获得了很好的酶切效果，但最后没有筛选出阳性克隆。
关键词：pUC19、pUC1301、亚克隆、限制性内切酶、感受态1前言初始克隆中的外源DNA片段往往较大，含有许多目的基因以外的片段，在诸如表达、序列标签和突变等操作中不变进行，因此必须将目的基因所对应的小片段DNA找出来，这个过程叫做亚克隆。
本实验是将pU1301中一段来自水稻1.5kb的片段亚克隆到pUC19上。
首先需要提取所需的质粒。
在大肠杆菌中质粒又大又小、拷贝数又多又要少，因此分离的方法也多种多样。
在实践中最常见的是通过将裂解法提取高拷贝的小质粒以及基于此方法的纯化技术，其他方法还有试剂盒分离纯化等，本实验通过试剂盒分离纯化E.coil质粒DNA。
将质粒提取出来后需要检测所获质粒的质量，方法有吸光值检测、凝胶电泳检测等。
要获得目的片段然后亚克隆与其他载体上，需使用两种工具酶：限制性内切酶、连接酶。
限制性酶切酶主要有三类，目前使用最多的是Ⅱ型。
限制性内切酶的使用需要在合适的条件下，当条件不合适时往往会出现星星活性。
限制性内切酶产生的黏性末端将导致载体自连，为了防止其自连，可以使用双酶切、去磷酸化、末端补平等方法。
连接酶是将两段核酸连接起来的酶，常用的有T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA连接酶、T4RNA连接酶。
目的片段和载体在连接酶作用下连接成一个整体，需借助一定方法导入受体细胞，首先需要制备感受态细胞，这类细胞处在易吸收外源DNA 条件下，然后通过电转化、CaCl2转化法将外源DNA导入受体细胞。
外源DNA 是否导入受体细胞，常用的做法是通过标记基因来筛选，而载体是否与目的片段连接使用α—互补筛选重组子。
LacZ编码β—半乳糖苷酶，在IPTG诱导下催化X-gal生成蓝色物质，当目的片段插入其中时，将导致β—半乳糖苷酶不能催化X-gal生成蓝色物质而是菌落显示白斑。
通过本实验可以掌握质粒的提取、感受态细胞的制备、酶切酶联反应、提取质粒质量检测等操作，对提高实验技能、科研素养有很大帮助，做完完整的实验可基本学会亚克隆的一般过程。
2材料与方法：2.1材料携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液、携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液2.2试剂Solution I:Tris.HCl（pH 7.5）50 mMEDTA10 mMRNase A100 µg/mlSolution II: NaOH0.2 MSDS 1 %Solution III:Final concentrationKAC 1.32 MUsing HAC to adjust pH to 4.8TE (pH 8.0)：Tris.HCl（pH 8.0）10 mMEDTA（pH 8.0） 1 mM苯酚/氯仿无水乙醇、异丙醇琼脂糖、0.5×TBE0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）上样缓冲液2.3方法：2.3.1质粒的提取取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37℃过夜培养。
用无菌牙签或接种环挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于摇床（37℃、250 r/min）培养过夜。
吸取1.5 ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉上清；再次吸取1.5 ml菌液收集菌体，尽量将菌液倒干净；加入300μl溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）加入300μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）加入300μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；12000 g离心10分钟，吸取800μl上清液（不要吸取到飘浮的杂质）至另一个1.5ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；12000 g常温离心10分钟；弃上清，加500μl 75％乙醇，浸洗片刻后离心5分钟（注意离心管的放置方向），弃上清；加40μl灭菌超纯水或TE 溶解；质粒的质量检测，-20℃保存。
2.3.2质粒提取质量检测将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上；配制0.8%的琼脂糖凝胶：称取0.24g琼脂糖于30ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；凝胶凝固后，小心拔去梳子.将DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，打开电泳仪，将电压调至不高于5V/cm，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。
2.3.3质粒酶切和效果检测将两种质粒分别使用酶切，在1.5ml的离心管中构建50μl反应体系（30μl 质粒DNA，1μlBamHI (10u/µl)，1μl Kpn I (10u/µl)，5μl10×buffer，13μl ddH2O），所有操作在冰上进行，分别取5μl酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果。
2.3.4酶连之前的处理将装有pUC1301的离心管放于65°C 10分钟，使酶终止反应。
将pUC19酶切产物纯化：加入ddH2O 150μl（扩大体积），加入200µl氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后离心10 min；吸出上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积乙醇，-20℃放置15分钟以上；12000 rpm 4℃冷冻离心15分钟；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10μl ddH2O，之后进行琼脂糖凝胶电泳。
在紫外灯下切下1.5kb的片段，称取凝胶重量，按3ml/g胶加入BufferDE-A，温浴75°C熔化凝胶加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，转移混合液到2ml离心管中，12000g 离心1min，弃滤液。
加500μlBufferW1，12000g离心30s,弃滤液，加700μlBufferW2，12000g离心30s,弃滤液加700μlBuffer W2，将制备管置于干净的1.5ml离心管中，在制备中央加入10μlEluent或去离子水，静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。
2.3.5去磷酸化与酶连将1.5kb的片段和pUC19去磷酸化。
构建40μl的体系（20μl DNA，0.5μl CIAP （TaKaRa），4.0μl 10⨯ buffer，15.5μl ddH2O），37℃或50℃反应30 min以上。
之后外源取4μDNAl、4μl目的载体DNA、1μl 10⨯ buffer、1μl T4 ligase (1U/μl)，16 ºC水浴保温过夜，使1.5kb的片段与pUC19连接。
2.3.6感受态细胞的制备及质粒的转化前夜接种受体菌（DH5α），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作，吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml 离心管中，在冰上冷却10分钟；4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；4℃下4000 rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入100μl 预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%～20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中250μl Amp，250μl X-gal，25μl IPTG，混匀后倒入灭菌培养皿中；取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；管感受态细胞分别加DNA连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；每管加400μl SOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏。
取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）。
3结果与分析图1质粒提取质量检测本人的结果为第一个泳道和第二个泳道，样品分别是pUC19、pUC1301。
pUC19两条带非常清晰，从上往下依次是线性的、超螺旋质粒。
理论上应该出现三条带，可能另一条量太少了没检测出来。
pUC1301质粒的条带不是很清晰，可能是大肠杆菌液中含量少的原因，也可能是部分降解或提取效果不好。
图2提取质粒质量检测与酶切酶切效果检测从左到右各泳道分别是：marker、对照pUC19、对照pUC1301、本人pUC19Bam HI+Kpn I酶切图、pUC1301Bam HI+Kpn I酶切图。
对照pUC19只有隐隐约约的一条带，对照pUC1301的一条带较清晰。
pUC19Bam HI+Kpn I酶切图与对照相比并无多大变化、pUC1301Bam HI+Kpn I酶切图显示了两条带，最下面一条分子量大小约 1.5kb,目的片段，但是效果不是很好，可能是提取的质粒有问题，或酶切下不好，只有部分质粒发生了酶切。
图2阳性对照感受态细胞加入了标准质粒，质粒中氨苄青霉素抗性基因，因此可在含有Amp的培养基上生长。
培养基中含有X-gal、IPTG，转化子在IPTG诱导下，催化X-gal产生蓝色物质，因此显示蓝色图3阴性对照感受态细胞中任何加任何DNA,因此不能再含有抗生素的培养基上生长，表现为无菌落长出。
图4转化菌株通过观察，培养基上没有长出菌落。
分析原因如下：感受态细胞效率低，目的片段分解、目的片段与载体连接反应中酶活力不够。
由于本人是最后一个切胶回收，可能前面耽误时间太长造成DNA片段分解。