分子克隆实验最全面解决方案设计综述

EcoR1和Xho1双酶切筛选
PCR筛选
• 1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质 粒。 • 二、特点： • 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检 测。 • 2、不能检测基因插入方向 • 3、不能检测基因内部突变。
测序验证
• 一、选取阳性克隆，送公司测序； • 二、特点： • 1、最可靠的检测方法。可确定基因的重 组，插入的方向，基因内部的突变等。 • 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
• 1、一次测序反应一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格 贵）－－60元左右。 • 2、测定的序列靠近引物（起点）20~30bp不准，500bp后的序列 也不准。 • 3、（1）质粒测序： 测序引物公司提供 （2）PCR产物直接测序： 测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。 注意: A. 测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引 物一般不能测序； B. 测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须 在50％～60%左右。
测序验证
表达筛选
• 一、SDS-PAGE筛选； • 二、亲和筛选； • 三、免疫筛选；
SDS-PAGE筛选
• 1、小量诱导表达； • 2、全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳； • 3、重组的表达克隆将在特定的位置出现 较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照） • 特点： • 1、可检测外源基因的表达。（一般基因 的插入，方向，读框都正确） • 2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。
【注意：（1）需要做一个无质粒的对照 （2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率－ －大约106【1ug PUC 质粒，产生克隆106 】
载体的制备
• 1、酶切（放大体积100 ul，要充分) • 2、胶回收（注意远紫外照射时间不能太长， 防止DNA突变） • 3、纯度，浓度测定。(电泳测定）
• 3、－20 ℃可保存半年；【－80 ℃可长期保存】
二、甘油菌活化：
• 1、取一管甘油菌，混匀；
• 2、用接种针接种并在培养平板上划线；
• 3、37 ℃倒置培养12 h； • 4、挑单克隆于2.5ml LB (视情况加抗生素），37 ℃振荡培养12 h. • 【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】
• 2、无法确定基因插入的方向；
• 3、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活， 将产生α互补，产生蓝斑。
酶切电泳筛选(*)
• 一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断 的大小。 • 二、特点： • 1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。 • 2、结果可靠但操作比较麻烦； • 3、无法检测基因内部的突变。
亲和筛选
• 1. 50 ml菌液诱导表达， • 2、超声破菌， • 3、用少量亲和beads吸附上清； • 4、SDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。 • 特点： • 1、适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测；
• 2、比SDS-PAGE筛选更灵敏（富集），可靠；
• 3、比较麻烦。
免疫筛选
质粒的提取原理－碱裂解法
•
(1)
Protocal:
1.5 ml 菌液， 12000 rpm * 1 min, 弃上清 （repeat) －－收集细菌
溶液1 (200 ul), 剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液 溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性 溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;－－－－－－－质粒复性 13000 rpm* 5 min, 取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA 540 ul 异丙醇， 室温 10 min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质 100 ul 2M NH4AC 13000 rpm* 5 min, 取上清； 100 ul 异丙醇，室温10 min; 14000 rpm * 10 min, 弃上清； 70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分 烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
• 其它溶液：
（1）2M NH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸； (2) 异丙醇-----------------------------沉淀质粒 （3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
溶液2：
0.2 mol/ NaOH--------------------核酸变性（pH>12或pH<3) (解链）
1% SDS-----------------------------蛋白变性，裂解细胞。
溶液3： 7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6) -------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。
• 用抗体检测目标蛋白： • Western blot（最准确） • ELISA (可能会受到酶活； • 亲和蛋白：与亲和底物作用。 • 其它的生物活性。
分子克隆流程
• • • • • • 1、分析基因，载体特点； 2、设计克隆策略； 3、检测基因，载体的正确性； 4、制备感受态细胞，目的基因，载体； 5、连接，转化。 6、筛选克隆 （1）Amp抗性初筛； （2）PCR筛选（或酶切筛选）； （3）表达筛选（SDS-PAGE和亲和筛选）； （4）测序验证 （5）生物活性筛选。
分子克隆实验原理
分子克隆实验原理
• • • • • • • • 一、菌种保存和活化 二、质粒提取和保存 三、感受态细胞的制备 四、载体的制备 五、基因的制备 六、连接 七、转化 八、重组克隆的筛选
菌种保存和活化
一.甘油菌保存：
• 1、 100 ul菌液＋100 ul灭菌甘油 【混匀】 • 2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】
感受态细胞的制备
• • • • • • • • 1. 菌种活化 2.取0.5ml菌液至50ml LB培养液中； 3、37 ℃ ，振荡培养2h至对数期； 4、转至50 ml无菌塑料管， 0 ℃ *10 min; 5、5000 rpm *10 min * 4 ℃ 6、取沉淀，加25ml 50mM CaCl2【0 ℃，无菌】 7、 5000 rpm *10 min * 4 ℃ 8、取沉淀, 加 2 ml 含15％甘油的50 mM CaCl2重悬，200 ul/tube 分装，液氮速冻后至－80 ℃冰箱保存（半年有效）。
克隆的Amp抗性 筛选
蓝白斑筛选
－－β半乳糖苷酶（Lac Z)的显色反应
• 一、α互补：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载 体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养 基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。（需要IPTG诱导表达）－－蓝 斑； • 二、外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行α互补－ －白斑。（√） • 三、特点： • 1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；
基因的制备(*)
• • • • 1、PCR扩增 2. 酶切 3、胶回收 4、纯度，浓度测定
连接
• 1、总体积为10 ul ； • 2、16 ℃连接过夜； • 3、基因mol /载体mol≈ 10 ; 【 平端≈ 15】
转化
• • • • • • • • • 1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
重组克隆的筛选*
• 1、抗性筛选；
• 2、蓝白斑筛选； • 3、酶切电泳筛选(*)；
• 4、PCR筛选；
• 5、测序验证；
• 6、表达筛选；
• 7、生物活性筛选。
抗性筛选
--质粒载体携带的筛选标记
• 1. AmpR （氨苄青霉素抗性）
• 2、TetR (四环素抗性）
• 3、KanR (卡那霉素抗性) 特点： 一般用抗性培养基做初级筛选， 只能保证有载体转入，不能保 证外源基因插入。
质粒的提取原理－碱裂解法
• 三种溶液：
溶液1：
50 m mol/l 葡萄糖----------------维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解； 25 m mol/l Tri·Cl （pH 8.0)---维持 pH; 10 m mol/l EDTA (pH 8.0)------螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA
初 (2)
(3) (4)
抽 (5)
(6) (7) (8)
精 (9) 抽
(10) (11) (12) (13)
除去少量杂质蛋白
(14)
(15)
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
质粒的保存
• 1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年] 2. 75%乙醇可长期保存. 3. 烘干可长期保存(可能难溶)