分子克隆实验标准步骤
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
分子克隆的基本流程
分子克隆的基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!分子克隆是一种在体外将 DNA 分子进行重组和扩增的技术，其基本流程包括以下步骤：1. 目的基因的获取：从生物体中提取总 DNA 或 mRNA。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆操作程序-ABclonal
分子克隆操作程序操作程序1 实验试剂及仪器1.1 试剂：质粒DNA小量试剂盒DNA 凝胶回收试剂盒DNA 产物回收试剂盒DNA 产物回收试剂盒Pfu，DNA marker，感受态DH5αBamHI酶，XhoI酶，EcoRI酶，T4 DNA ligase 1.2 实验仪器：PCR仪离心机凝胶成像系统：Tanon 2500，天能公司1.3 耗材：实验中所用到的PCR管，枪头2 试验步骤2.1 引物的稀释2.1.1引物一般以干粉形式保存于-20℃，临用前稀释。
12.1.2 由于引物呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。
然后在装有引物的管内根据引物说明书加入双蒸水稀释至10uM，盖上管盖，充分上下振荡30秒，再次离心，小离心机30秒(管上标注好引物名称、浓度、稀释时间)2.2 PCR扩增反应体系在0.2ml离心管中加入以下成分：（做多管的时候可以把除引物模板以外的组分混合后分装）轻弹混匀，离心收集管壁上的液滴至管底, 在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下（不同基因的退火温度以及延伸时间略有差异,退火温度为引物Tm 上下5℃）94℃ 3 min94℃30sec58℃40sec72℃(1kb/min)2372℃ 8min4℃ ∞反应结束后，取2ulPCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并以DNA Marker 6ul 做对照。
120V 恒压条件下电泳20min 后，于凝胶成像系统下观察并将电泳图贴到记录本中（扩增产物大约30ng/μl ）2.3 PCR 产物的回收2.3.1 如果扩增产物条带单一用 Axygen AP-PCR-250纯化PCR 产物，具体操作按试剂盒说明书进行（回收产物用35ul ddH 2O 洗脱两遍）2.3.2 如果出现非特异性扩增， 目的产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收（AP-GX-250），具体操作按试剂盒说明书进行 （回收产物用35ul ddH 2O 洗脱两遍） 2.4目的产物及载体酶切目的产物酶切（在1.5ML 离心管中加入以下成分, 以BamHI 和XhoI 为例）振荡混匀，短暂离心； 载体酶切（载体使用中抽质粒试剂盒）37℃温育过夜；80℃水浴20min 终止反应2.5 酶切产物回收酶切产物用DNA 产物回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行（目的产物酶切用35ul ddH2O 洗脱两遍，载体酶切用50ul ddH2O 洗脱两遍），将电泳图贴到记录本中。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子克隆实验标准步骤一、常规分子克隆实验流程：二、分子克隆实验标准步骤（含实验编号）：1.PCR扩增目的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo（TOYOBO）为例体系（50ul）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate 50-200ngKOD 0.5ulddH2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。
在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。
3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3）以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。
④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
⑥重复操作步骤⑤。
⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。
将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或ddH2O，室温放置2min。
12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
4.酶切反应（编号Clone SOP-4）以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）：10×FastDigest® buffer or 10×FastDigest® Green buffer 5ulFastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ulFastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ulDNA NddH2O up to 50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。
5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5）以本实验室常用Axygen® AxyPrep™ PCR Clean-Up Kit（Axygen）为例①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的Buffer PCR-A（若Buffer PCR-A不足100ul，加至100ul），混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12000g 离心1min，弃滤液。
②将制备管置回2ml离心管，加700ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。
③将制备管置回2ml离心管，加400ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。
④将制备管置回2ml离心管，12000g离心1min，将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，静置2min。
⑤在制备管中央加25-30ulEluent或ddH2O，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。
6.重组反应（编号Clone SOP-6）以本实验室常用NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒（Novoprotein）为例体系：10×重组缓冲液1ulNovoRec®重组酶0.5ul线性化载体N插入片段NddH2O upto10ul注：载体与目的片段的摩尔比在1:3-1:10之间进行重组反应混匀后在37℃水浴锅中放置20至30分钟后取出置于冰上立即进行转化7.转化（编号Clone SOP-7）①从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，迅速置于冰上缓慢解冻并分装。
②取出连接产物，加入到分装的感受态中，置于冰上孵育25min③42℃热激90sec，置于冰上孵育2min，加入700ul，不含抗生素的LB培养基，180rpm37℃培养45min。
④3000rpm离心1min，弃去大部分上清液体，留下约50-100ul，重悬沉淀，滴在已经加入玻璃珠的LB平板（带有相应抗性）上，用玻璃珠涂抹均匀。
⑤倒出玻璃珠，LB平板置于37℃培养箱，过夜培养。
8.挑克隆摇菌与菌落PCR检测阳性克隆（编号Clone SOP-8）①从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，用镊子小心镊取高压灭菌后的枪头，以枪头的尖头轻触单个克隆，然后将枪头尖分别在装有有150ulLB液体（带有相应抗性）的1.5mlEP管和菌落PCR反应体系中搅动几下。
将装有培养基的EP管37℃220rpm培养3小时。
②菌落PCR：20ul菌落PCR体系，以本实验室常用2×TSINGKE Master Mix为例：2×MIX 10ulPrimer 1 0.5ulPrimer 2 0.5ul菌ddH2O 9ul菌落PCR程序：95℃3min95℃30s58℃30s 30cycle72℃1-2kb/min72℃5min12℃∞③琼脂糖电泳检测PCR产物以判定阳性克隆9.菌液的扩大培养（编号Clone SOP-9）将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10ul接种至5ml LB（含抗性）培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养。
10.小提质粒（编号Clone SOP-10）取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取（天根质粒DNA小提试剂盒）。
①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µl的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
②取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，4500rpm离心5分钟，尽量吸除上清，将菌体沉淀收集到一个离心管中。
③向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（事先已加入RnaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
④向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。
⑤向离心管中加入300µl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。
12,000rpm(~13,400×g)离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色可再次离心后取上清。
⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。
12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑦向吸附柱CP3中加入600µl漂洗液PW（事先已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑧向吸附柱CP3中加入600µl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
⑨将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除。
⑩将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80µl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。
置于4℃备用。
三、实验过程注意事项1.PCR实验请注意酶的扩增效率，有的酶是1kb/min，有的是2kb/min，具体请查看相应酶的说明书。
2.琼脂糖凝胶制备过程中请注意污染区与非污染区，在电泳点样前请确保样品和DNA Marker已加入核酸染料。
3.试剂盒使用之前检查漂洗液是否已加入无水乙醇。
四、常用培养基与缓冲液的配制：1.LB液体培养基（1L）配方：10g 胰化蛋白胨(Tryptone)5g 酵母提取物(Yeast extract)5g NaCl用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟。
2.LB液体培养基（1L）配方：10g 胰化蛋白胨(Tryptone)5g 酵母提取物(Yeast extract)5g NaCl15g琼脂粉用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟。
3.TB液体培养基（1L）配方：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。
各组分溶解后高压灭菌。
冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g 的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml，高压灭菌）。