分子克隆技术实验指导
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆 实验指南 第三版
分子克隆实验指南第三版
引言部分可以简要介绍分子克隆的概念、重要性和基本原理。
实验准备部分可以列出所需的主要仪器、试剂、菌种等,并对一些关键材料的选择和存储给出注意事项。
实验步骤部分可以按照顺序介绍主要的实验过程,如制备质粒载体、制备靶向DNA片段、连接反应、转化感受态细胞、笛卡尔计数和克隆笼选等。
对于每个步骤,可以概括说明原理和关键点。
实验注意事项部分可以总结一些可能遇到的常见问题及其对策建议。
可以介绍分子克隆技术的一些发展趋势和应用前景。
以上只是一个大致框架,具体内容需要根据版本定位和编写者的实际要求来决定。
无论如何,我都会避免直接引用任何可能构成版权侵权的内容。
分子克隆 实验指南 第三版
分子克隆实验指南第三版
《分子克隆实验指南第三版》是一本专门介绍分子克隆技术的实验手册。
分子克隆是现代分子生物学研究中一种非常重要的技术,广泛应用于基因工程、蛋白质工程、基因组学和转基因生物等领域。
该书主要包括以下几个方面的内容:
1. 分子克隆的基本原理和概念
2. 分子克隆常用的实验材料和试剂配制
3. 核酸(DNA和RNA)的提取和纯化方法
4. 限制性内切酶的使用
5. 质粒载体的选择和构建
6. 基因的克隆和重组
7. 克隆产物的检测和鉴定
8. 基因的表达和蛋白质的纯化
该书以实用性为主,提供了大量详细的实验步骤和注意事项,适合分子生物学和基因工程等相关专业的学生和科研工作者使用。
我尽量概括介绍了该书的主要内容,但没有复制或引用任何版权内容。
如果需要更多详细信息,可以查阅该书的正式出版物。
分子克隆技术实验讲义(最终版)
分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识（一）T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。
在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。
（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。
所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。
相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。
（三）大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。
分子克隆技术实验操作手册
分子克隆技术实验操作手册《分子克隆技术》实验操作手册李香花吴昌银邢永忠华中农业大学生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子杂交和表达检测三部分分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting 等。
Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素或DIG)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经显影或显色显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。
本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
分子克隆部分实验报告
一、实验目的1. 学习分子克隆的基本原理和方法；2. 掌握质粒的提取、纯化、线性化及目的基因的插入等实验操作；3. 熟悉DNA的纯化、鉴定及重组载体的构建等实验技术。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因片段从基因组DNA中分离出来，并在宿主细胞中复制和扩增的过程。
实验过程中，利用限制性内切酶切割目的基因和载体，通过连接酶将二者连接形成重组载体，然后转化宿主细胞，筛选出含有目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pET-28a2. 目的基因：EGFP3. 限制性内切酶：BamHI、EcoRI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA分子量标准：DL20006. DNA纯化试剂盒7. 转化宿主细胞：大肠杆菌DH5α8. LB培养基、氨苄青霉素9. 等等四、实验步骤1. 质粒提取与纯化（1）按照试剂盒说明书提取质粒DNA；（2）用DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA；（3）检测质粒浓度和纯度。
2. 目的基因的线性化（1）用BamHI和EcoRI双酶切目的基因片段和载体；（2）用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物；（3）检测酶切产物浓度和纯度。
3. DNA连接（1）将纯化的目的基因片段和载体进行连接反应；（2）将连接产物转化大肠杆菌DH5α；（3）在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养转化菌。
4. 阳性克隆的筛选（1）提取转化菌的DNA；（2）用BamHI和EcoRI双酶切提取的DNA；（3）电泳检测酶切产物，筛选出与预期大小相符的重组质粒；（4）将重组质粒进行测序验证。
五、实验结果与分析1. 质粒提取与纯化：质粒浓度约为50ng/μl，纯度大于0.8。
2. 目的基因的线性化：酶切产物浓度约为10ng/μl，纯度大于0.8。
3. DNA连接：转化菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长良好。
4. 阳性克隆的筛选：电泳结果显示，重组质粒大小与预期相符。
5. 重组质粒测序验证：测序结果与预期序列一致，表明目的基因已成功插入载体。
分子克隆实验指南
做了快一年的分子克隆，犯了很多错误，经历了很多坎坷，也学到了很多东西。
分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。
经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。
关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。
但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。
有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。
以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。
通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。
做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。
常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。
dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG 位点（W是A或T）并甲基化。
如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。
容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（A TC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。
这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。
如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。
甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。
我个人强烈建议第二种，连T载体。
因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子克隆技术DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。
实验前准备实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。
还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。
本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳性克隆，测序分析及得到正确的重组质粒。
GenBank查询目的基因序列打开NCBI主页，在搜索栏中输入β-Actin的登录号NM_007393，点击search。
选择核酸数据库，进入搜索结果界面，可见β-Actin的相关信息。
在CDS选项中，找到编码区所在位置，β-Actin的CDS位点为80-1207，点击复制编码序列，并保存为.seq格式。
根据CDS序列设计引物打开DNAstar的MapDraw软件，点击File，下拉菜单中打开CDS.seq，点击ok后可见CDS的酶切位点。
点击工具栏中的Map，选择Absent Sites，可见该片段所缺少的酶切位点。
结合本次实验所用载体pET-28α的图谱分析，确定上游引物的酶切位点为Bam HⅠ，下游引物的酶切位点为Hin dⅢ。
打开Primer Premier5软件，点击File，选择New，DNA Sequence。
在弹出的Gene Tank窗口中，粘贴入β-Actin的基因全长序列，选择As is，ok确定.点击Primer进入Primer Premier窗口，点击Search，在Search Criteria窗口选择PCR Primer，search type选项中选择Pairs。
还可以设定搜索区域及产物长度。
由于CDS的位置是80-1027，上游引物搜素区域为1-80bp；下游则为1027-1885bp；产物长度为900-1300bp；引物长度一般为18-30bp，无需修改。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，设置完毕后，点击ok开始搜索引物。
搜索结束后，在Search Progress窗口点击ok。
弹出Search Result窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序。
点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
选择评分最高的引物，简单查看一下引物情况，避免出现一下情况：3’不要出现连续3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配；T m 应该在55～70度之间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好；GC％应该在45％～55％间。
选中上游引物，点击Edit Primer。
在引物编辑窗口的编辑栏中，5’端添加入Bam HⅠ的序列（GGATCC）,点击Analysis.根据结果添加合适的保护碱基。
再次分析后，点击Primer。
如符合条件，点击OK，将编辑好的引物输送到序列上。
同样的方法设置下游引物，在编辑栏中5’端添加入Hin dⅢ的序列（AAGCTT）和保护碱基，注意：此时应该从3’端到5’端输入序列。
分析好各种参数后，点击OK，接受引物。
最后在Primer Primer窗口查看该对引物的各种参数，可用BLAST将设计好的引物与β-Actin序列进行比对分析。
如果新引物参数不够理想，可重新选择符合条件的另一对引物进行编辑及分析。
引物确定后，进行Blast分析，一般来说，都会找到一些其他基因的同源序列，此时，只要没有交叉的其他基因的同源序列即可。
RT-PCR获取目的基因设计好引物后，通过RT-PCR钓取目的基因首先配制PCR体系，在PCR管中加入2μl 10× Taq buffer、1.2μl的25mM MgCl2、0.2μl 10mM dNTP、上下游引物各0.3μl、0.3μl Taq酶，经过反转录获得的cDNA 模板2μl，最后加RNA酶纯水调整至20μl。
短暂混匀后，瞬时离心将所有溶液收集到管底。
PCR反应是使用Thermo Scientific Arktik PCR仪进行扩增反应，PCR仪程序设置为95°C预变性5 min，95°C变性30s，55°C退火40s，然后72°C延伸30s ，72°C 2min, 扩增循环数为28个循环，最后在12 °C保温。
注意，每对引物的退火温度不一样，实验前需进行反应条件的优化。
延伸时间需根据产物长度及Taq酶的扩增效率决定时间的长短。
程序设定好后，放入PCR管，盖上热盖，旋紧旋钮，点击run按钮，选择设定好的程序，按START开始运行。
扩增结束后，取出PCR管，扩增产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测琼脂糖凝胶电泳制备1%琼脂糖凝胶，在锥形瓶中加入0.3g的琼脂糖和30ml的TAE缓冲液，加热时应盖上封口膜或保鲜膜，以减少水份蒸发，微波炉加热至琼脂糖全部融化。
待混合物冷却至50-60℃时，将其倒入胶槽中。
待凝胶凝固后，轻轻拔去梳子，将胶放入电泳槽中，并倒入适量的TAE缓冲液。
假如适量的6× Loading Buffer，混匀后即可上样。
分别将样品全部加到上样孔中，并点上2μl marker。
注意：上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
加样完成后，盖上电泳槽盖，90V恒压电泳，指示剂迁移至凝胶的2/3处，即可停止电泳。
取出凝胶，置于EB中浸泡20min后凝胶扫描仪下查看电泳结果。
胶回收及DNA的纯化在紫外下，将特异电泳带用刀尽可能切下放入到1.5ml的离心管中，称琼脂糖带的重量。
在含琼脂糖带的离心管中分别加入相应比例体积的Buffer GM，于55到65℃水浴中温浴，每2-3 min摇动混合物至凝胶完全融化，将离心柱装在收集管内，把获得的DNA熔胶液全部转移至离心柱中，静置1min，12000rpm室温离心2min，弃收集管中的滤液，将离心柱套回收集管内。
若DNA凝胶溶液体积超过700μl，重复以上操作，将剩余DNA凝胶溶液转移到离心柱中。
弃收集管中的滤液，将离心柱套回收集管内。
加700μl已含无水乙醇的Buffer WB至离心柱中。
12000rpm室温离心2min。
注意：Buffer WB在使用之前必须确定是否已加入合适比例的无水乙醇。
重复用700μl Buffer WB洗涤离心柱一次。
最后弃收集管中的滤液后重新将离心柱放回收集管内。
室温下,12000rpm离心2 min以除去离心柱基质上残余的液体。
把离心柱装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入30μl的Elution Buffer到柱基质上，室温放置1min, 12000rpm离心1min以洗脱DNA。
回收得到的DNA 溶液放在-20℃保存或直接进行下一步的酶切。
酶切目的基因和载体酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。
在扩增产物组标记为T，载体组标记为C的PCR管中加入如下成分：2μl 10x 酶切缓冲液，6μl的蒸馏水，Bam HⅠ和Hin d Ⅲ各1μl。
T组加入PCR扩增产物10μl，C组加入10μl pET-28α载体10μl。
混匀后，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底，37°C酶切3-4h，酶切结束后，65°C保温5-10min以终止酶切及防止DNA末端退火，取出后置冰浴骤冷，酶切产物可直接进行连接反应。
目的基因和载体连接反应连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
在实验组标记为T的PCR管中加入4μl DNA酶切产物，1.5μl pET-28a载体，1μl 10x T4连接buffer，0.5μl T4 DNA连接酶，加水补足到10μl。
在阴性对照组标记为C的PCR管中加入1.5μl pET-28α载体，1μl 10x T4连接Buffer，0.5μl T4 DNA连接酶，加水补足到10μl。
对于有效的连接体系来说合适的载体和目的基因分子数比值控制在一定范围内是有必要的，这个比值为1：3-1：10，较大的片段可适当提高比值。
连接时，PCR产物浓度可以尽可能的大，轻混反应物，并在16℃连接12-16h，也可以置于4℃连接过夜。
转化及筛选转化前，需进行大肠杆菌感受态细胞的制备接种10μl大肠杆菌DH5α甘油菌至含有2ml LB液体培养基的试管中，37℃每分钟180-200rpm振荡培养过夜。
以1%的接种量将甘油菌种20μl接种到2ml LB 培养基中，37℃振荡培养，使菌液OD 600达到0.3～0.4，此过程大约需要3h。
菌液在4°C条件下，以5000rpm离心2min，回收菌体；在超净工作台里用枪头小心移去上清，将菌体重新悬浮于400μl预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬时操作要轻，加入适量无菌甘油，混匀，冰浴放置20min，分装制备得到的感受态置于-80°C储存备用，也可将感受态置于冰上12-24h后，可以直接进行转化。
整个操作中细胞保持在冰冷的状态。