分子克隆技术实验讲义(最终版)
最新2分子克隆

BamH Ⅰ
GGATCC CCTAGG
(4)酶靶顺序大小是很重要的,它决定产生特定DNA中段的大小。
若DNA碱基组成是均一的,限制酶切点是随机的,那么对于: ① 要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷 酸即可遇到一个靶序列,即1/256 ② 同理,要求6bp的酶,则平均46遇到一个靶序列,即1/4096。
MboⅠ和 SauSⅠ( -NN↓GATCNN-3′) -NNCTAG↓NN-5′
(2)识别顺序同,切割位点不同,如:
SmaⅠ CCC↓GGG 和 XmaⅠ C↓CCGGG
(3)识别与切割相同,但其中一酶可以切“修饰” (甲基化*),另一酶不能。如:
HpaⅡ→CCGG 和 MspⅠ→CCG*G
MboⅠ→GATC 和 Sau 3A →GA*TC
3′-G↑ACGT C-5′ 3′-G
ACGTC-5′
还有一些酶沿对称轴切割DNA,产生平端或钝端(blunt end) 如SmaI:
5′-CCC↓GGG-3′ 5′-CCC
GGG-3′
3′-GGG↑CCC-5′ 3′-GGG
CCC-5′
几种特殊的内切酶
1.异源同工酶(Isoschizomers)也称同裂酶:来源 不同,识别顺序相同,切割方式可同可不同: (1)识别顺序与切割方式同,如:
特点:分子水平操作,细胞水平表达
基本原理
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接
DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达
第二节 工具酶
常用的工具酶(tool enzymes)有:
1.限制性核酸内切酶(resriction enzymes,restriction endonadease) 2.DNA连接酶(DNA ligase,ligase) 3.逆转录酶(reverse transcriptase) 4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol) 5.核酸酶(nuclease) 6.末端转移酶(terminal transferase) 7.碱性磷酸酶(BAP或CIP) 以1. 和2. 最为常用,最为重要。工具酶现已商品化。
植物生物技术研931-分子克隆PPT课件

质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp,容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因,可以作为选择标记;
受体细胞内,pBR322以多拷贝存在,一般一个细胞内可达到15个,而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下,可达到1000-3000拷贝,如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
28
Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用:体外转录
.
19
质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液,去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体,去除染色体DNA及大部分 蛋白质
分子克隆技术讲解课件

pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322),因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因,赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322),这个基因上有两个点突变, 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长,用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种,其优点 是可以用来插入较大的DNA片段,再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒,有一个复制起点,一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点,多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段,用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株(M15)时,因为由质粒表 达的α-肽补充了大肠杆菌却失的α-肽,所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上,长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA,由于它破坏了α-肽的 表达,因而在加入IPTG和X-gal的培养基,不 能长出蓝色克隆,这就是所谓的蓝白筛选。
分子克隆实验

质粒提取试剂盒使用方法:
1. 用1.5 ml离心管收集1.5-5ml菌液,12000rpm离心60秒,弃上清。 2. 参加200µl溶液Ⅰ/RNase A混合液,漩涡振荡使菌液完全重新悬浮。 3.参加 200µl溶液Ⅱ,温和反复颠倒混匀4-10次,室温放置1-2分钟,以获得澄清的裂
分子遗传学实验
PCR产物克隆及质粒的少量制备 〔8学时〕
实验目的
掌握DNA回收、基因克隆、克隆筛选、质粒提取和DNA测 序的原理和方法
认识到基因克隆在基因工程领域地位,理解基因工程的含 义与应用
实验流程
分
目的基因
基因载体
总 体
切
技
术
目的基因的获得
路
载体DNA的选择
接
线
重组:DNA片段与载体连接
PMD 18 T载体
PCR产物克隆
1. PCR回收产物的连接〔Takara T载体试剂盒〕
2. 连接产物的转化 从-70冰箱中取热激感受态100ul〔视转化效率而定〕冰溶,取连 接产物5ul~10ul于感受态中充分混匀。冰浴30分钟,42℃水浴 中热激90秒,迅速置于冰上2分钟,而后参加600ul的LB培养基, 37℃复活40分钟。
1~200kb之间,具有双链闭合环状构造的DNA分子。主要发现于 细菌、放线菌和真菌细胞中。具有自主复制和转录能力。 ⑴ 分子量相对较小,在细菌中稳定存在,拷贝指数高。 ⑵ 具有遗传标记: 如抗生素性基因 —半乳糖酶基因〔LacZ 〕 ⑶ 具有多个酶的单一切点。称多克隆位点〔multiple cloning sites , MCS〕
12000rpm离心60秒,管底即为质粒DNA。
酶切鉴定
分子克隆课件

分子克隆目录(一).基本概念 (2)1.分子克隆: (2)2. Dalton,bp,nt (2)3.保护碱基 (2)4.T-A克隆: (2)5.RNA酶H活性: (2)6.载体: (2)7.质粒(plasmid) (2)8. F因子 (3)9. 位点偏爱(Site preference) (3)10.星星活性: (3)(二)分子克隆的基本过程 (3)1.概述 (3)2.分子克隆中常用工具酶 (3)3.基因克隆常用载体 (7)4.目的基因的分离与制备 (11)5.目的基因的体外重组 (11)6.重组子导入宿主细胞 (12)7.阳性重组子的筛选和鉴定 (13)(三).单链丝状噬菌体 (14)1.M13 噬菌体的生物学 (14)2. M13 噬菌体载体 (17)3. M13 噬菌体载体的宿主菌 (18)4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 (17)5. 噬菌粒 (11)6. M13KO7 辅助噬菌体 (12)(一).基本概念1.分子克隆:是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组,将重组分子导入到合适的受体细胞中,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得DNA分子大量复制,并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。
2. Dalton,bp,nt道尔顿(Dalton,Dal,Da,D):分子量的单位,蛋白质是大分子,所以常用kDa(千道尔顿)来表示。
碱基对(bp)=base pair,1 kb就是1000个碱基对;nt=核苷酸nucleotide 。
3.保护碱基在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开,因此在设计PCR引物时,人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。
4.T-A克隆:利用Taq酶在PCR产物3‘末端有加上一个A的特性,使得Taq酶的PCR 产物或经过Taq酶加A的PCR产物,和一个人工加上一个3’末端具有1个T的载体进行连接,由于突出末端可以互补,这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。
分子克隆载体 ppt讲义转pdf

UUUU...…
RNApol RNA pol
5¢ 5 ¢ 3¢ 3 ¢ 3¢ 3 ¢ 5¢ 5 ¢
5´pppG 5
茎环结构使转录终止的机理 茎环结构使转录终止的机理
一、pBR322
调控序列
增强子 启动子
结构基因
UAS 酵母
TATA
核糖体结合位点(S-D序列)
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno),又称为核糖体结合点。
3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA
表达体系的发展
表达体
第一代 原核生物表达体系 第二代 酵母表达体系 第三代 哺乳类细胞表达体系 第四代 基因直接导入
载体
质粒、噬菌体 穿梭质粒 病毒、脂质体 DNA本身
宿主
细菌 酵母 培养细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结 合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修 饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知 识,应用已知的调控序列进行重组、改造。
P
O
Z Y X
诱导物 诱导物
乳糖(或IPTG)
P O
Z Y X
Am
lacZ
N H 2
COOH
a片段 片段
w片段 片段
lacZ
标志补救(ß-半乳糖苷酶法) ß 半乳糖苷酶法)
分子克隆技术实验讲义最终版样本

分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一・实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握X® I酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaC12法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二.相关知识(一)T载体的制备PMD18-T Vector 种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)的商业化专用载体,由pMC 18载体改建而成。
在pMC 18多克隆位点处的Xbal和Sa/I 识别位点之间插入了EcoRV识别位点,用EcoRV进行酶切反应后,再左两侧的3,端添加” T”而成,能够大大提高PCR产物的连接.克隆效率。
相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3) PCR等。
(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到启一类型载体中,例如从某种质粒克隆到另一种质粒,这个过程称为亚克隆。
所谓重组,就是把外源目的基因''装进"载体的过程,即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中,需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理,一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子,使其与相同酶切过的载体分子相互连接,彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体,如专门用于克隆PCR产物的载体,大大方便了实验操作。
相关知识点:(1)克隆与亚克隆;(2) DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。
《分子克隆实验设计》PPT课件

检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
18
测序验证
一、选取阳性克隆,送公司测序; 二、特点: 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组,插入的方向,基因内部的突变 等。 2、价格贵,适于1~2个克隆的验证。
(3)70%乙醇---------------------------沉淀质粒,除去异丙醇,盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理-碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, ----------------- 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.----除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
6
质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
11
转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中; 2、混匀,冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s----热击,促进DNA进入cell 4、冰上1~2min--使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)--外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h--Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s,浓缩100ul 8、涂板(Amp板)--抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
16
酶切电泳筛选(*)
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分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识(一)T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)的商业化专用载体,由pΜC 18载体改建而成。
在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点,用EcoRⅤ进行酶切反应后,再左两侧的3′端添加“T”而成,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3)PCR等。
(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中,例如从某种质粒克隆到另一种质粒,这个过程称为亚克隆。
所谓重组,就是把外源目的基因“装进”载体的过程,即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中,需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理,一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子,使其与相同酶切过的载体分子相互连接,彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体,如专门用于克隆PCR产物的载体,大大方便了实验操作。
相关知识点:(1)克隆与亚克隆;(2)DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。
(三)大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后,需将其导入受体细胞进行扩增和筛选,得到大量、单一的重组体分子,这就是外源基因的无性繁殖,或称为克隆。
受体细胞也叫宿主细胞,大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。
感受态细胞(competent cell)是经过一定方法处理后,具有接受外源DNA能力的大肠杆菌,只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。
相关知识点:(1)克隆;(2)宿主细胞的定义及分类;(3)感受态细胞定义及其功能;(4)转化定义及方法(DMSO、MnCl2、TB aq、PEG)等。
(四)重组DNA的转化及重组子的鉴定将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。
把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的,一是大量产生重组DNA分子,在完成连接反应后,重组DNA分子往往只有纳克级的量,不易操作和进行下一步的分析,若把重组DNA分子导入到细菌细胞中,细菌细胞可分裂多次产生克隆,克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子,这样重组DNA分子的量就多了;二是对重组DNA 分子进行纯化,在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子,连接过程完成以后体系中有多种分子存在,除了需要的重组DNA分子以外,还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子,未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大,因为它们即使导入细菌细胞,因为不能复制,很快就要被细菌细胞中的酶降解掉;对克隆工作带来影响的是后两种分子,因为它们都为环状,在细菌细胞中都能复制,因而都能产生克隆,但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子,每个单克隆都是由一个细胞形成的,因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。
所以只要对不同的克隆进行筛选,就可以鉴定所需的重组DNA 分子。
所谓的重组子(recombinant)也叫做转化子(transformant)是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。
将重组子从其它细胞群中(如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段)分离出来,并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因,这过程称为筛选(screening)。
根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同,初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选,直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法;间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法;本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。
相关知识点:①转化(transformation)质粒(plasmid)②转染(transinjection) 噬菌体(phage)③显影注射(1)导入的方法④电转化 2.5kv⑤基因枪geneblaster⑥脂质体介导法⑦其它方法:快速冷冻法、碳化硅纤维介导法(2)重组子:转化子(3)重组反应体系中的成分:①②③④⑤⑥(4)筛选的方法DNA鉴定筛选法:定位、测序①直接筛选法选择性载体筛选法:λph包裹、抗药性α-互补分子杂交筛选法:ISH、Southern Blot免疫化学免疫学方法②间接筛选法酶免疫检测mRNA翻译检测法(五)质粒DNA的提取(碱裂解法)原核生物没有真正的细胞核,DNA一般位于一个类似“核”的结构——称为类核体上(因为不是一个完整的细胞核)。
E.coli的遗传物质主要是染色体DNA ,E.coli的染色体为双股环状DNA,含有 1 400个以上的基因,另外还有一些质粒DNA。
1、质粒的概念质粒是细菌(如 E.coli)染色体外的小型环状双链DNA分子。
一般说来,质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构,就细胞生存而言,质粒是可有可无的。
质粒分子本身含有复制功能的遗传结构,故能在细菌内独立地进行复制,并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
2、研究质粒的意义(1)质粒作为一种裸露的,比病毒更简单、更有自主复制能力的DNA分子,正好处于生命与非生命的分水岭上。
由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息,说明质粒是独立的有机体,是亚细胞生命体系的成员,是比病毒更简单的原始生命形态,所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。
(2)要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中,需要运载工具。
携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。
由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力,因此,质粒作为基因工程的重要运载工具,在现代分子生物学占有重要地位。
3、质粒的分类不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同,根据质粒在细胞中拷贝数的多少,Rownd(1969)把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒。
(1)严密型质粒(stringent plasmid):严密型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒,其DNA 的复制与宿主染色体DNA的复制相偶联,受到某种程度的控制,每个细胞仅有1-2个拷贝。
(2)松驰型质粒(relaxed plasmid):松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力的质粒,其复制是在松驰控制下进行的,每个细胞的拷贝数约为10~200个。
当向培养基中加入氯霉素时,细胞的蛋白质合成被抑制,细胞染色体DNA和严密型质粒DNA的复制停止,松驰型质粒DNA的复制继续进行。
松驰型质粒DNA的拷贝数可达数百个,基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。
相关知识点:(1)质粒的分类:①与宿主相关程度:严密型质粒(stringent plasmid)、松弛型质粒(relaxed)②是否有转移基因:接合型质粒、非接合型质粒③带有特殊用途的基因:生殖质粒(F质粒)、抗性质粒(R-质粒)、col质粒(编码杀死其他细菌的蛋白质)、降解质粒、致病质粒(Ti)(2)质粒的提取方法:煮沸法、CsCl、试剂盒、碱裂解法;(3)质粒的构型:①SC构型:cccDNA (covalently closed circle DNA)②OC构型:ocDNA (open circle DNA)③L构型:L-DNA (linearDNA) O L S三、实验原理(一)T载体的制备XcmⅠ是一种Ⅲ型的限制性核酸内切酶,其识别序列为:5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5其中阴影部分为XcmⅠ的识别序列,“^”为XcmⅠ的切割位点,其识别序列中间的9个任意核苷酸(N)对XcmⅠ的酶切特异性及酶切效率没有影响。
为了能得到用XcmⅠ酶切后3′末端均是T的载体,本实验利用了XcmⅠ的识别序列的特点,引物的3′端带有XcmⅠ酶切位点,其序列如下:Primer1:5′-CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAAT- 3′Primer2:3′- TCTCTAAGGTA TGC^A TATGACCCGC- 5′引物中“^”为XcmⅠ的切割位点,当XcmⅠ对PCR得到的线性片段进行酶切的时候,便会产生一个与T 载体形式完全一样的3′-T粘性末端。
(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)1988年,Clarke发现所有的PCR产物都在Taq DNA聚合酶的作用下在3′端附加上了一个3′突出的腺苷酸,因为Taq DNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性,可在双链DNA末端加上一个单一的3′突出的dATP,利用Taq DNA聚合酶的这一特性,在克隆载体上附加3′胸腺嘧啶(dTTP)形成T-A 克隆系统,即可直接对PCR产物进行有效的克隆,这样的载体称为T-载体。
(三)大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备技术是从20世纪70年代初期发展起来的,当时人们发现如果把 E.coli 细胞浸在一冰冷的盐溶液,它吸收DNA分子的能力要比不浸的细胞强;经过摸索和总结,人们终于采用50 mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液来制备感受态细胞。
其他的盐(如氯化铷RbCl)也很有效。
尽管对这一处理的确切机制仍不清楚,但有人对感受态提出了两种假说,一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁结构或局部溶解,让外源DNA分子通过质膜进入;另一种认为DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处于感受态时表面形成了一种可接受DNA的酶位点。
一旦细胞被处理制备成感受态细胞,它们就能稳定地摄取外源DNA分子了。
(四)重组DNA的转化及重组子的鉴定转化是使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。
一般认为DNA分子在转化过程中将经历四个阶段,第一个阶段是吸附阶段,完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的表面;第二个阶段为转入阶段,双链DNA分子解链,以单链的形式进入细胞,而另一链则被降解;第三阶段是自身稳定阶段,外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA;第四个阶段是表达阶段,即目的基因随同质粒的复制子一起复制。