拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建
拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化
拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化张静;田兆丰;朱文壮;张飞云【摘要】旨在制备柯浩体的标志蛋白-Awoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定.通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件.表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化.结果显示,原核表达载体pET28a-Atlg 13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确.在IPTG浓度为0.7mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高.经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)003【总页数】6页(P63-68)【关键词】Atcoilin蛋白;表达;纯化;标志蛋白【作者】张静;田兆丰;朱文壮;张飞云【作者单位】首都师范大学生命科学学院,北京100048;北京市农林科学院植物保护环境保护研究所,北京100097;首都师范大学生命科学学院,北京100048;首都师范大学生命科学学院,北京100048【正文语种】中文柯浩体（Cajal bodies，CBs）最早是由西班牙神经科学之父，科学家Cajal在1903年发现存在于细胞核附近的一种亚核结构。
随后，科学家们研究发现在哺乳动物、两栖动物、昆虫、植物以及酵母的细胞中都有其相似的结构存在[1,2]。
到目前为止，已经发现拼接复合体snRNPs、与组蛋白mRNA 3'-末端剪接有关的U7 snRNPs以及与rRNA前体剪接有关的snoRNPs都定位在柯浩体上[2]。
之前的研究结果表明，snRNPs和snoRNPs只有在柯浩体上经过加工、修饰后才能形成具有功能的复合体，并定位在speckles和核仁中，分别行使mRNA和rRNA前体的拼接和剪接功能。
拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建
拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建王云，任永兵，杨硕，韩宇，陶杨，曹树青(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段，再克隆到pUCm-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因。
从AtMYB61一pUCm-T载体上，用BstEII和BglII全双酶切切下目的基因片段，将此基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA2301中。
菌落PCR和酶切鉴定结果表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA2301一AtMYB61。
利用电转化法将重组表达载体导人根癌农杆菌中，获得了携带AtMYB61基因的根癌农杆菌株，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究A ￡MyB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。
关键词：拟南芥；AtMYB61基因；表达载体Cloning of Arabidopsis thaliana AtMYB61 geneand the expression vector constructionW ANG Yun， REN Yong-bing， YANG Shuo， HAN Yu， TAO Yang， CAO Shu-qing(School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)Abstract：Tota1 RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and used as the template to amplify the full length of eDNA of AtMYB6 1 gene by RT_PCR technology，and the gene fragment was subsequently cloned into plant pUCm-T vector．The results of bacterial colony PCR，enzyme analysisand eDNA sequencing confirmed that the Arabidopsis thaliana AtM YB6 1 gene was successfully cloned．AtMYB61 gene was cut completely from AtMYB61一pUCm-T vector by BstE 1]and BglⅡ，and the gene fragment was cloned into plant expression vector pCAMBIA2301．The results of bacterialcolony PCR and enzyme analysis showed the Successfu1 construction of plant expression vector pCAM—BIA2301一AtM YB61．In addition，the recombinant expression vector was carried into Agrobacterium tumefaciens by electrotransformation，and the strain of Agrobacterium tumefaciens carrying AtM YB6 1 gene was obtained．The study provides a basis for improving the resistance of transgenic plants and further exploring the molecular mechanism of AtM YB6 1 gene．Key words：Arabidopsis thaliana；AtMYB6 1 gene；expression vector0 引言随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，将外源抗逆基因导人植物的基因工程技术，在提高植物抗逆性方面具有更广泛的应用前景。
生物技术实验设计方案-- 棉花MYB转录因子的克隆与载体构建
西北农林科技大学生物技术实验设计方案题目：棉花MYB转录因子的克隆与载体构建院（系）：专业：班级：姓名：学号：成绩：完成日期：棉花MYB转录因子的克隆与载体构建1、棉花MYB转录因子的克隆与载体构建的研究背景和目的、意义1.1 棉花MYB转录因子的克隆与载体构建的研究背景MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。
MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。
分子结构是每隔约18个氨基酸规则间隔的色氨酸残基，它们参与空间结构中疏水核心的形成。
有时色氨酸残基会被某个芳香族氨基酸或疏水氡基酸所取代，尤其是在植物R2R3-MYB转录因子中，R3MYB 结构域的第一色氨酸经常被亮氨酸、异亮氮酸或苯丙氨酸所取代。
其次，在每个保守的色氨酸前后都存在一些高度保守的氨基酸，例如在第一个色氨酸的C-末端通常是一簇酸性氨基酸正是上述这些保守的氨基酸残基使MYB结构域折叠成螺旋-螺旋-转角-螺旋结构。
特点及功能是参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节，苯丙烷类代谢是植物主要的3条次生代谢途径之一，它起始于苯丙氨酸，经过几个共同步骤后，分成两个主要分支途径，其中一条分支称为黄酮类代谢途径，主要与植物色素合成相关。
R2R3-MYB转录因子作为调节蛋白广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控，主要的证据来自对欧芹、玉米、金鱼草和矮牵牛中黄酮类分支途径的生化和遗传学研究。
MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用；对MYB转录因子基因LHY和CCA1的研究结果显示，它们可能通过对光信号的应答参与植物生理节律的调控。
前人研究进展MYB转录因子具有高度保守的DNA结合域——MYB结构域。
在每个MYB区域中，一般都含有3个保守的色氨酸残基，其间隔为18～19个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持螺旋-转角-螺旋（HTH）的构型起着非常重要的作用。
拟南芥基因的克隆和在油菜花中的表达
m iR395d前体基因的 前体基因的PCR扩增结果 前体基因的 扩增结果
3. PCR产物的回收与测序 产物的回收与测序
PCR 产 物经 琼 脂糖凝 胶电泳回收试剂盒回 收 后 与 克 隆 载 体 pMD19 TVector连接, 转化DH5α感受态细胞, 在含有Isop ropyl2β2D 2thiogalactoside( IPT G) 、 X2gal 和 Amp 的 LB平板上挑选单克隆, 单克隆经鉴定后送金 思特生物公司测序。
1. 拟南芥 拟南芥DNA的提取 的提取
法从幼嫩的拟南芥叶片中提取DNA。 用CTAB法从幼嫩的拟南芥叶片中提取 法从幼嫩的拟南芥叶片中提取 。
拟南芥m 拟南芥 iR395d前体茎环发夹图 前体茎环发夹图
2.拟南芥 iR395d前体基因的克隆 拟南芥m 拟南芥 前体基因的克隆
参照拟南芥miR395d前体基因序列设计引物, 为了便于 miR395d过表达载体的构建, 在上游引物的5′端加入了B glⅡ酶切位点, 下游引物5′端加入了SpeⅠ酶切位点, 以拟 南芥DNA为模板, PCR扩增466 bp左右的miR395d前体 基因。引物序列如下: 上游引物S1: 上游引物S1: 5’AGATCTATGTCACCCATCCTATCTTCCTCA23′ 下游引物S2: 下游引物 5′ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA2ACCTGTA23′ PCR反应体系 10 ×缓冲液(含Mg2 + ) 5µL, 10 mmol·L - 1 反应体系: 反应体系 dNTP 2µL, 10µmol·L - 1引物各2 µL, cDNA 第1 链模板2 µL, Taq酶( 5 U ·µL - 1 ) 1 µL, ddH2O 38 µL。扩增条件如 下:94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个 循环; 72 ℃ 7 min。
拟南芥基因的克隆和在油菜花中的表达
MicroRNAs (miRNAs) 是一类内生、非编码蛋白长 度约为21～24个核苷酸的单链小分子RNA,在生物 体内起着基因转录后的调控作用。对miRNA 作用 机制研究显示, 成熟的miRNA 先与一种叫R ISC (RNA2induced silencing comp lex) 的复合物结合, 接着再特异性地与靶mRNA结合, 即与碱基互补的 同源mRNA 配对结合, 引起靶mRNA的降解; 而当 miRNA与靶mRNA不完全互补时, miRNA则通过与 对应的靶mRNA 的3′端非翻译区( 3′UTR) 结合阻止 其转录后的翻译。由于植物中的miRNA与其靶 mRNA具有高度的碱基互补性, 因而植物miRNA可 能更像siRNA的作用方式对靶基因进行降解 。相反, 在动物细胞中, 大多数miRNA与其靶mRNA并不完 全精确互补, miRNA则通过与对应的靶mRNA的3′ 端非翻译区( 3′UTR) 结合阻止转录后的翻译, 从而 起到负调节其靶基因的表达作用。
表达载体pCAMBIA1304的T2DNA区结构 的 表达载体 区结构
重组质粒的酶切鉴定
农杆菌EHA105菌液 菌液PCR 农杆菌 菌液
5.根癌农杆菌介导法转化油菜 根癌农杆菌介导法转化油菜
无菌苗培养: 选取籽粒饱满的油菜种子用70%乙醇 无菌苗培养 选取籽粒饱满的油菜种子用 乙醇 表面消毒30 再用 再用1 消毒5 表面消毒 s,再用 g·L - 1 HgCl2 消毒 min, 无 菌水冲洗5次 接种于种子萌发培养基(MS) 上, 置 菌水冲洗 次, 接种于种子萌发培养基 25 ℃光照培养箱中 每天光照 h。预培养 待无 光照培养箱中, 每天光照12 。预培养: 菌苗长至第7天 菌苗长至第 天, 分别切取子叶和下胚轴为转化的 外植体, 置于预培养基(MS +2 mg·L - 1 6 BA + 011 外植体 置于预培养基 黑暗预培养3 。 mg·L - 1 2, 4 D, pH 612) 中, 黑暗预培养 d。
本科生物医学工程选题
1.水稻HD3外源基因花粉逃逸能力2.接种AM真菌对黄芪生长及有效成分的影响3.丛枝真菌对食叶草生长发育影响4.红心火龙果全息蛋白质组提取方法优化5.拟南芥ANNAT4基因植物表达载体的构建6.四环素浓度对大豆植株生长的影响7.拟南芥GSNOR1基因的克隆及其序列分析8.应用植物凋落物分解评估溪流生态系统健康研究进展9.AMF复合菌剂对水稻育苗影响10.香蕉果皮发酵富钾液肥方法优化11.一株马铃薯晚疫病拮抗菌C1-17发酵条件优化12.甜菜M14品系愈伤组织的诱导研究13.氯氟吡啶酯对稻田土壤真菌多样性的影响14.城市厨余垃圾生产高品质园艺用土研究进展15.拟南芥IPUT1基因植物表达载体的构建16.一株类芽孢杆菌菌株对烟草生长表型的影响17.一株马铃薯晚疫病拮抗菌发酵条件优化18.大城市厨余垃圾资源化处理研究进展19.转基因抗虫水稻对土壤细菌的影响20.烯禾啶对肇东苜蓿生长的影响21.外源苯甲酸对紫苏种子发芽和幼苗生长的影响22.拟南芥GSNOR1基因植物表达载体的构建23.干旱胁迫下甜菜M14品系表型分析24.不同海拔梯度小叶章种群土壤真菌群落结构和多样性25.拟南芥IPUT1基因的克隆及其序列分析26.Cd胁迫下丛枝菌根真菌与印度梨形孢对土壤酶活的影响27.印度梨形孢产功能酶的初步研究28.不同果肉颜色火龙果全息蛋白质组提取技术优化29.水稻HD2外源基因对土壤微生物的水平转移30.拟南芥ANNAT4基因原核表达载体的构建31.鸡胚原代细胞培养生长曲线模型研究32.拟南芥SMXL1基因的克隆及其序列分析33.水稻食味品质遗传研究进展34.氮沉降对红松人工林土壤碳降解相关酶活性的影响35.北方水稻耐盐碱QTL定位分析36.植物激素对汉麻愈伤组织诱导的影响研究37.BvM14-RIN4基因真核表达载体的构建以及互作蛋白预测38.印度梨形孢提高植物抗逆能力的研究进展39.稻花香2号与龙粳31香味基因的差异性分析40.不同pH条件下耐酸真菌产功能酶初步研究41.龙粳31香味基因OsBadh2的定点敲除42.拟南芥BIN2基因的克隆及其序列分析43.拟南芥IPUT1基因原核表达载体的构建44.甜菜M14品系转录因子WOX8转录激活活性分析45.好氧反硝化细菌的筛选分离鉴定及其脱氮性能研究46.丛枝菌根真菌对大豆植株Cd转运和累积的影响47.汉麻愈伤组织的诱导和分化研究48.一个玉米蛋白酶抑制剂基因克隆与生物信息学分析49.利用花药培养技术创建稻花香2号与空育131杂交衍生的双单倍体群体50.产L-肉碱的菌种筛选及发酵条件的优化51.利用测序定位分析亚麻抗白粉病基因52.不同激素对甜菜愈伤组织诱导的影响53.益生菌发酵果蔬汁营养成分及功能特性的研究进展54.不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响55.重组鸡EED基因在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计56.甜菜BvEXP-A10-like基因的克隆及分析57.拟南芥SMXL1基因原核表达载体的构建58.水稻产量相关性状遗传研究进展59.一株贝莱斯芽孢杆菌X3-2抑菌功能研究60.模拟氮沉降对土壤氨基糖影响的研究进展61.AMF提高植物抗铅胁迫的研究进展62.精喹禾灵对肇东苜蓿生长的影响63.重组人铁蛋白在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计64.利用定点改变技术修饰空育131中的NPT1基因65.高产蛋白紫苏品种选育66.拟南芥BIN2基因植物表达载体的构建67.一株马铃薯晚疫病拮抗菌X3-2发酵条件优化68.不同海拔小叶章种群土壤酶活性69.红松人工林土壤碳氮转化酶对氮沉降的响应70.镉胁迫下异形根孢囊霉对汉麻抗逆性酶活性的影响71.甜菜原生质体制备工艺的优化72.甜菜根腐病源菌分离鉴定73.不同海拔梯度小叶章种群土壤理化性质74.一株马铃薯晚疫病拮抗枯草芽孢杆菌分离鉴定75.高寒地区厨余垃圾生产EM肥菌群变化分析76.沙棘真菌分离鉴定77.耐酸微生物抗重金属毒性的研究进展78.吡氟酰草胺对不同土壤微生物群落结构影响79.不同浓度TiO2对甜菜M14品系幼苗生长的影响80.甜菜愈伤组织诱导的激素筛选研究81.玉米芯腐熟剂--开创复合菌剂新未来（创新创业成果）82.氮沉降背景下森林土壤微生物多样性的研究进展83.玉米自交系Mo17蛋白酶抑制剂基因原核表达载体构建84.玉米丝氨酸蛋白酶抑制剂原核表达载体构建85.定向改良水稻第8染色体香味基因的TALEN载体的构建86.枯草芽孢杆菌分离鉴定87.半纤维素酶高产菌株的筛选88.利用测序分析亚麻自然群体的遗传结构89.长白山不同海拔梯度土壤理化性质的变化90.甜菜M14品系叶片愈伤组织的诱导91.一株耐锰真菌的分子鉴定及对重金属耐受能力的初步研究92.水稻HD1外源基因花粉逃逸能力93.AMF复合菌剂对水稻育苗影响94.香蕉果皮发酵富钾液肥方法优化95.一株马铃薯晚疫病拮抗菌C1-17发酵条件优化96.甜菜M14品系愈伤组织的诱导研究97.氯氟吡啶酯对稻田土壤真菌多样性的影响98.城市厨余垃圾生产高品质园艺用土研究进展99.拟南芥IPUT1基因植物表达载体的构建100.一株类芽孢杆菌菌株对烟草生长表型的影响101.一株马铃薯晚疫病拮抗菌发酵条件优化102.大城市厨余垃圾资源化处理研究进展103.转基因抗虫水稻对土壤细菌的影响104.烯禾啶对肇东苜蓿生长的影响105.外源苯甲酸对紫苏种子发芽和幼苗生长的影响106.拟南芥GSNOR1基因植物表达载体的构建107.干旱胁迫下甜菜M14品系表型分析108.不同海拔梯度小叶章种群土壤真菌群落结构和多样性109.拟南芥IPUT1基因的克隆及其序列分析110.Cd胁迫下丛枝菌根真菌与印度梨形孢对土壤酶活的影响111.印度梨形孢产功能酶的初步研究112.不同果肉颜色火龙果全息蛋白质组提取技术优化113.水稻HD2外源基因对土壤微生物的水平转移114.拟南芥ANNAT4基因原核表达载体的构建115.鸡胚原代细胞培养生长曲线模型研究116.拟南芥SMXL1基因的克隆及其序列分析117.水稻食味品质遗传研究进展118.氮沉降对红松人工林土壤碳降解相关酶活性的影响119.北方水稻耐盐碱QTL定位分析120.植物激素对汉麻愈伤组织诱导的影响研究121.利用花药培养技术创建稻花香2号与空育131杂交衍生的双单倍体群体122.产L-肉碱的菌种筛选及发酵条件的优化123.利用测序定位分析亚麻抗白粉病基因124.不同激素对甜菜愈伤组织诱导的影响125.益生菌发酵果蔬汁营养成分及功能特性的研究进展126.不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响127.重组鸡EED基因在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计128.甜菜BvEXP-A10-like基因的克隆及分析129.拟南芥SMXL1基因原核表达载体的构建130.水稻产量相关性状遗传研究进展131.一株贝莱斯芽孢杆菌X3-2抑菌功能研究132.模拟氮沉降对土壤氨基糖影响的研究进展133.AMF提高植物抗铅胁迫的研究进展134.精喹禾灵对肇东苜蓿生长的影响135.重组人铁蛋白在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计136.利用定点改变技术修饰空育131中的NPT1基因137.一株马铃薯晚疫病拮抗枯草芽孢杆菌分离鉴定138.高寒地区厨余垃圾生产EM肥菌群变化分析139.沙棘真菌分离鉴定140.耐酸微生物抗重金属毒性的研究进展141.吡氟酰草胺对不同土壤微生物群落结构影响142.不同浓度TiO2对甜菜M14品系幼苗生长的影响143.甜菜愈伤组织诱导的激素筛选研究144.玉米芯腐熟剂--开创复合菌剂新未来（创新创业成果）145.氮沉降背景下森林土壤微生物多样性的研究进展146.玉米自交系Mo17蛋白酶抑制剂基因原核表达载体构建147.玉米丝氨酸蛋白酶抑制剂原核表达载体构建148.定向改良水稻第8染色体香味基因的TALEN载体的构建149.枯草芽孢杆菌分离鉴定150.半纤维素酶高产菌株的筛选151.利用测序分析亚麻自然群体的遗传结构152.长白山不同海拔梯度土壤理化性质的变化153.甜菜M14品系叶片愈伤组织的诱导154.一株耐锰真菌的分子鉴定及对重金属耐受能力的初步研究155.水稻HD1外源基因花粉逃逸能力156.水稻HD3外源基因花粉逃逸能力157.拟南芥ANNAT4基因的克隆及其序列分析158.分子标记在水稻遗传育种中的应用159.云南樟叶精油微波法提取及抑制活性研究160.黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区不同森林类型土壤微生物功能多样性分析161.水稻HD4外源基因对土壤微生物的水平转移162.甜菜GRAS转录因子全基因组家族鉴定及生物信息学分析163.利用分离群体定位分析亚麻抗白粉病基因164.异丙甲草胺对肇东苜蓿生长的影响165.农业对源头溪流底栖动物群落结构与功能的影响166.烯草酮对肇东苜蓿生长的影响167.世界三大黑土区利用和保护措施的论述168.模拟氮沉降对三江平原小叶章湿地土壤微生物碳代谢的影响169.接种AM真菌对黄芪生长及有效成分的影响170.丛枝真菌对食叶草生长发育影响171.红心火龙果全息蛋白质组提取方法优化172.拟南芥ANNAT4基因植物表达载体的构建173.四环素浓度对大豆植株生长的影响174.拟南芥GSNOR1基因的克隆及其序列分析175.应用植物凋落物分解评估溪流生态系统健康研究进展176.高产蛋白紫苏品种选育177.拟南芥BIN2基因植物表达载体的构建178.一株马铃薯晚疫病拮抗菌X3-2发酵条件优化179.水稻基因gfr分子检测体系及其应用180.不同海拔小叶章种群土壤酶活性181.红松人工林土壤碳氮转化酶对氮沉降的响应182.镉胁迫下异形根孢囊霉对汉麻抗逆性酶活性的影响183.甜菜原生质体制备工艺的优化184.甜菜根腐病源菌分离鉴定185.不同海拔梯度小叶章种群土壤理化性质186.拟南芥ANNAT4基因的克隆及其序列分析187.分子标记在水稻遗传育种中的应用188.云南樟叶精油微波法提取及抑制活性研究189.黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区不同森林类型土壤微生物功能多样性分析190.水稻HD4外源基因对土壤微生物的水平转移191.甜菜GRAS转录因子全基因组家族鉴定及生物信息学分析192.利用分离群体定位分析亚麻抗白粉病基因193.异丙甲草胺对肇东苜蓿生长的影响194.农业对源头溪流底栖动物群落结构与功能的影响195.烯草酮对肇东苜蓿生长的影响196.世界三大黑土区利用和保护措施的论述197.模拟氮沉降对三江平原小叶章湿地土壤微生物碳代谢的影响198.BvM14-RIN4基因真核表达载体的构建以及互作蛋白预测199.印度梨形孢提高植物抗逆能力的研究进展200.稻花香2号与龙粳31香味基因的差异性分析201.不同pH条件下耐酸真菌产功能酶初步研究202.龙粳31香味基因OsBadh2的定点敲除203.拟南芥BIN2基因的克隆及其序列分析204.拟南芥IPUT1基因原核表达载体的构建205.甜菜M14品系转录因子WOX8转录激活活性分析206.好氧反硝化细菌的筛选分离鉴定及其脱氮性能研究207.丛枝菌根真菌对大豆植株Cd转运和累积的影响208.汉麻愈伤组织的诱导和分化研究209.一个玉米蛋白酶抑制剂基因克隆与生物信息学分析。
拟南芥基因克隆的策略与途径
RACE
利用已知的转录本序列设计引物，通过PCR扩 增得到完整的转录本序列。
表达序。
基于表型的基因克隆策略
定位克隆
通过将表型与基因组连锁分析，定位到目标基因所在的染色体区间，再通过精细定位确定目标基因。
候选基因法
根据已知的生物学功能或代谢途径，筛选可能导致特定表型的候选基因，并进行克隆和验证。
03
拟南芥基因克隆的途径
克隆载体的选择与构建
质粒载体
质粒是一种可以独立复制的DNA分子，常用于克隆和表达基因。根据拟南芥基因的特点，选择适合的质粒载 体进行构建。
病毒载体
病毒载体是一种高效的基因转移和表达系统，可用于拟南芥基因克隆。构建适合拟南芥的病毒载体，确保目的 基因在拟南芥中稳定表达。
基因片段的获取与鉴定
鉴定新的功能基因
通过研究新的功能基因，可以更深入地了解拟南芥的生长发育机制和适应环境的能力，为作物改良和农业生产提供新的思路 和方法。
研究基因的协同作用
拟南芥的生长发育受到许多基因的协同作用。研究这些基因之间的相互作用和调控机制，有助于更全面地了解拟南芥的生 长发育过程。
探索基因编辑技术在农业中的应用
反向PCR
通过已知序列设计引物，从基因组DNA中扩增目标 基因。
正向PCR
通过已知基因的部分序列设计引物，从基因组DNA 中扩增完整基因。
链接PCR
通过已知基因的两端序列设计引物，从基因组DNA 中扩增完整基因。
基于转录组的基因克隆策略
差异显示PCR
比较不同组织或发育阶段的转录本，找出差异 表达的基因。
拟南芥基因克隆的意义与应用
拟南芥基因克隆对于研究植物生长 发育、响应环境变化、抗病抗虫等 方面具有重要意义，有助于揭示植 物适应环境的机制和开发新的农业 育种技术。
拟南芥动蛋白基因AtKP1的克隆_表达及生物化学特性分析
-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档The Best Literature----------------------------------The Best Literature第52卷 第6期 2007年3月论 文拟南芥动蛋白基因AtKP1的克隆、表达及生物化学特性分析李绪彦①* 王海庆①②* 徐 涛① 曹勤红① 任东涛① 刘国琴①†(① 中国农业大学生物学院, 植物生理与生物化学国家重点实验室, 北京 100094; ② 中国科学院西北高原生物研究所, 青海 810001.* 同等贡献. † 联系人,E-mail:***********.cn)摘要 动蛋白(kinesin)种类很多, 在真核细胞中行使多种功能. 利用3′-RACE 技术从拟南芥中克隆了动蛋白-14B 亚家族中的一个成员, 命名为AtKP1 (拟南芥动蛋白1). 其最大可读框为3.3 kb, 编码1087个氨基酸. 结构域分析表明, AtKP1多肽链中部有一个马达结构域, 氨基端有一个CH 结构域, 羧基端一个含有202个氨基酸残基的序列表现出很强的特异性. Northern 印迹表明, AtKP1基因在各种器官中广泛表达, 但在幼苗中表达量最大. 将克隆的长度为2808 bp 的AtKP1启动子区域与GUS 基因进行了融合, 转基因分析显示, AtKP1主要在幼嫩器官维管束和幼叶表皮毛中表达, 表明AtKP1可能参与了维管束和叶表皮毛的分化或发育. 对AtKP1的马达结构域进行了原核表达和亲和纯化, 生物化学特性研究表明这个马达结构域可以核苷酸依赖的方式与微管结合, 且具有微管激活的ATP 酶活性.关键词 动蛋白 cDNA 克隆 表达模式 微管结合 ATP 酶活性2006-12-18收稿, 2007-02-26接受国家自然科学基金(批准号: 30370708, 30421002和30671049)和科技部植物转基因研究与开发专项(批准号: JY03-A-03)资助项目动蛋白(或称驱动蛋白)是一类依赖于微管的马达蛋白, 广泛存在于真核生物细胞中[1]. 动蛋白超级家族的成员都具有高度保守的马达结构域, 大约含 350个氨基酸残基, 具有微管和ATP 结合位点, 能产生沿微管运动的驱动力[2]. 在马达结构域之外, 动蛋白超级家族成员表现出氨基酸序列的多样性, 因而表现出功能的多样性[3]. 通过马达结构域进化树分析, 动蛋白被分成10多个亚家族[4,5].继在烟草花粉中鉴定出植物动蛋白后[6], 已有多种植物动蛋白基因被克隆、鉴定, 并且发现它们在植物发育过程中功能的多样性. 有的参与了胞质分裂, 如拟南芥中的kat 基因家族成员(KatA , KatB 和KatC )[7~9], NACK1, NACK2[10], HINKEL [11], TET-RASPORE [12], POK1和POK2[13]; 有的参与了植 物形态建成[14,15]和纤维素微纤丝的定向沉积[16]; AtMKRP1和AtMKRP2则具有线粒体定位信号, 很可能与线粒体功能相关[17]; 有一个拟南芥动蛋白异型体与联体病毒组复制蛋白发生相互作用[18]. 另外, 在棉纤维细胞中还发现了一个有CH 域(calponin homology domain; 一类微丝结合蛋白结构域)的动蛋白GhKCH1, 在体外可以和肌动蛋白相结合, 在体内与周质微管共分布[19]. 随着拟南芥基因组的测序, 推测拟南芥中有61个类动蛋白基因[20]. 然而, 迄今为止, 大多数动蛋白还没有得到鉴定.本研究利用3′-RACE 的方法克隆到了一个动蛋白基因, 命名为AtKP1; 对 AtKP1进行了Northern 印迹分析, 并且利用它的启动子区域和GUS 报道基因进行融合, 通过转基因观察了它在体内的表达模式. 另外, 对 AtKP1 马达结构域的原核表达产物进行了ATP 酶活性和微管结合能力分析. 上述研究对了解植物动蛋白异型体的结构特点、表达规律以及生物化学特性具有重要的理论意义.1 材料与方法(ⅰ) 生物材料. 以拟南芥(Arabidopsis thaliana ; Columbia ecotype)为试材, 在12 h 光周期、22℃和70%相对湿度条件下培养; pGEM T-easy 载体购自 Promega (Madison, WI, USA), 用于基因克隆和测序; 大肠杆菌菌株BL21 (DE3)和表达载体pET-30b (+)购自Novagen (Madison, WI, USA), 用于表达AtKP1重组蛋白; pBI121 载体购自Clontech (Clontech, CA, USA), 用于植物转化.(ⅱ) AtKP1 cDNA 的分离与序列分析. 用TRIzol (Gibicol, Grand Island, NY USA)试剂按操作论文第52卷第6期 2007年3月说明从拟南芥的幼茎中提取总RNA. 根据Mitsui等人[7]的报道合成下列克隆动蛋白马达结构域的兼并引物Pkin1 (5′-ATCTTYGCATAYGGACAPAC-3′)和Pkin2 (5′-GTPTAIGGIATGTCITTIAGITTYGAITG-3′). 以2 µg的总RNA为模板, 以Pkin1为引物进行反转录; 以合成的cDNA的第1链为模板, 用引物Pkin1和Pkin2 PCR扩增得到双链cDNAs.用3′- RACE 技术获得cDNA的3′端区域. 首先, 以2 µg总RNA为模板、Pkin3 (5′-GTTTTCCCAGT- CACGACd(T)15-3′) 为引物进行反转录, 然后以获得的第1链 cDNA 为模板进行第1轮的PCR, 所用的正向引物为Pkin4 (5′-GCTGGGTTCGTTTCTAAGG- AA-3′), 没有加入反向引物. 然后以第1轮的PCR产物作为模板, 加入正向巢式引物Pkin5 (5′-GGCC- AGATCTGATGACC-3′)和适配子引物AP (5′-GTTT- TCCCAGTCACGAC-3′)进行第2轮PCR.根据拟南芥基因组预测的序列和获得的3′端区域, 设计引物Pkin6 (5′-CCCAATTTATTTCCGCGT-3′)和Pkin7 (5′-TGGGACACTCGTTCTTTATGA-3′), 进行RT-PCR扩增获得全长的cDNA序列. 将扩增的产物克隆到pGEM T-easy 载体进行测序. 同源基因的搜索、氨基酸序列比对以及依据马达结构域序列的系统树的构建分别在下面的网站上进行: http://www. /blast/Blast.cgi; http://searchlauncher. /multi-align; http://www.genebee.msu.su/ services/phtree_reduced.html.(ⅲ) Northern 印迹分析. 用TRIzol试剂从拟南芥成熟植株的根、茎、叶、花、幼荚和两周的幼苗中提取总RNA. 20 µg的总RNA经1.2%甲醛变性凝胶电泳后转移到带正电荷的尼龙膜上(Amersham). 用引物Pk22 (5′-GCGTCGACTGGTACCATGAACCTT- GCA-3′) 和 Pk23 (5′-CATATGCTTCACACTGATAA- CTCTTCA-3′) 扩增AtKP1 cDNA的特异片段, 用[α-32P] dCTP进行同位素标记, 以此作为探针进行同位素杂交.(ⅳ) GUS表达分析. 为了检测AtKP1基因在体内的表达模式, 从拟南芥基因组中克隆了AtKP1基因起始密码子上游2808 bp的序列, 引物设计为PM1 (5′-GCAAGCTTCGGTCAACTGAAC-3′, 上游引物)和PM2 (5′-GCTCTAGACTGTCTCAGCCATG-3′, 下游引物). 扩增的PCR片段克隆导入pBI121表达载体的Hin d Ⅲ和XbaⅠ位点, 正好位于GUS(β-Glucur- onidase)报告基因的上游. 利用花芽浸泡的方法[21]获得了30个独立的转基因株系. 收集幼苗和转基因成熟植株的不同器官进行组化染色, 37℃染色24 h后用于GUS基因表达的检测[22].为了进一步详细观察GUS染色部位, 采用整体透明的方法, 将GUS染色的材料转移到含有0.24 mol/L 盐酸的20%甲醇溶液中, 57℃处理15 min, 具体操作按Malamy等人[23]报道的方法进行. 整体透明后的材料在Olympus BH-2光学显微镜下观察并照相.(ⅴ) AtKP1马达区在大肠杆菌中的表达和纯化. 为了表达带有组氨酸标签的AtKP1重组蛋白, 以Pk24 (5′-GC GAATTC TCTCCGGGTCATGTAGAAG-3′)和Pk19 (5′-GC GTCGAC TGACTTTCTCTGCTTGCC- AG-3′)为引物进行PCR扩增, 获得了包含马达结构域的全长1506 bp的cDNA片段. 将此片段克隆进大肠杆菌表达载体pET-30b (+)的EcoRⅠ和SalⅠ位点; 构建好的表达载体转进大肠杆菌菌株BL21(DE3), 在25℃的培养条件下, 用0.2 mmol/L的 IPTG (iso- propyl-β-D-thio-galactopyranoside)诱导24 h, 使目的蛋白大量表达. 随后用镍柱(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)进行亲和纯化. 对于纯化得到目的蛋白, 利用小鼠动蛋白的单克隆抗体(Sigma, 1∶5000稀释)进行了免疫印迹验证. 蛋白浓度测定采用Bio-Rad蛋白分析试剂盒(Bio-Rad, CA, USA).(ⅵ) 微管结合与ATP酶活力分析. 为了进行微管结合分析, 我们参照Williams等人[24]的报道用三轮聚合-解聚循环的方法从新鲜猪脑中纯化得到微管蛋白. 在微管蛋白溶液中加入2 mmol/L GTP和30 µmol/L紫杉醇, 37℃水浴聚合30 min; 然后将聚合的微管(1.40 mg/mL)、纯化的马达结构域原核表达产物(0.20 mg/mL)以及10 mmol/L ATP和 5 mmol/L AMP-PNP混合, 37℃温育 15 min; 最后30℃, 14000 × g离心30 min, 对上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测.微管激活的ATP酶活力分析: 100 µL AtKP1马达结构域原核表达产物的制备物(0.44 mg/mL)中加入100 µL聚合好的微管(2.7 mg/mL), 37℃温育15 min 后加入20 µL ATP (20 mmol/L), 继续温育15 min, 最后加入20 µL 100% 三氯乙酸混匀终止反应(对照实验中三氯乙酸在加入ATP以前加入). 反应终止后在冰上放置10 min, 4℃ 10000×g离心10 min, 取上清, 然后按照 LeBel 等人[25]的方法进行无机磷测定. 实验重复3次.第52卷 第6期 2007年3月论 文2 结果与分析2.1 AtKP1 cDNA 的克隆及序列分析根据动蛋白马达结构域的保守序列设计兼并引物, 用 RT-PCR 从拟南芥幼茎中得到了621 bp 的cDNA 片段(结果未显示), 对 GenBank 数据库中搜索结果表明这个片段的核酸序列非常类似于根据拟南芥基因组推测的一个类动蛋白序列(T32N15.10). 然而根据此序列设计引物并没有克隆到动蛋白基因, 表明预测序列可能与真实序列存在差距. 因此采用 了 3′-RACE 的方法, 分离得到包含polyA 的3′端序列(结果未显示). 根据此序列和预测的T32N15.10 5′端序列, 得到了全长3607 bp 的cDNA 序列, 命名为AtKP1 (Arabidopsis kinesin protein 1; GenBank 登录号: AF398149; 登录时间: 2002年). 这个基因含有3264 bp 的可读框, 编码 1087个氨基酸(图1(a)). 事实证明,我们得到的序列与基因组预测的序列之间确实存在着很大的差异: AtKP1的43~91位氨基酸序列以及825~1040氨基酸序列通过基因组预测不出来, 并且C 末端1064~1087 位氨基酸序列与基因组预测的序列也不相同(图2(a)), 这可能是我们最初根据基因图1 拟南芥动蛋白基因AtKP1的序列分析(a) AtKP1 cDNA 的核酸序列和推测的氨基酸序列. AtKP1 GenBank 登录号为AF398149. (b) AtKP1和其他动蛋白的序列系统树分析. 构建系统树所用的动蛋白: AtKATD/AtKinesin-14B (AF080249), AtKATA/AtKinesin-14A (D11371), AtFRA1/AtKinesin-4 (AY158083), AtPAKRP1/AtKinesin- 12A (AF193767), AtNACK1/AtHIK (AB081599)和AtNACK2/AtTES (AB088121) 来自Arabidopsis thaliana ; DmNCD/Dm Kinesin-14 (X52814)来自Drosophila melanogaster ; GgChrkin/GgKinesin-4 (U18309)来自Gallus gallus ; NtTKRP125/NtKinesin-5A (D83711)来自Nicotiana tabacum ;XKLP2/XKinesin-12 (X94082)来自Xenopus laevis ; CgMCAK/CgKinesin-13 (U11790)来自Cricetulus griseus论文第52卷第6期 2007年3月图2 AtKP1与GenBank中对应基因AtT32N15.10蛋白的对比(a) AtKP1蛋白的推测序列与GenBank中对应基因AtT32N15.10蛋白的推测序列的差异; (b) 结构域预测显示AtKP1蛋白含有CH结构域、卷曲螺旋、ATP结合区及微管结合区(b)组预测序列无法得到全长AtKP1的原因. 对cDNA序列与基因组序列比较发现, AtKP1基因有15个内含子, 序列长度从76~198 bp不等, 其中有13个内含子分别在其5′和3′端包含GU和AG二核苷酸, 符合5′和3′拼接的GU-AG规律[26].AtKP1含有1087个氨基酸残基, 分子量约为130 kD (图1(a)), 其中间区域 375~713位氨基酸序列非常类似于动蛋白超级家族高度保守的马达结构域, 与AtKATD (登录号: AF080249)马达结构域的同源性高达70.9%, 与AtKATA (登录号: D11371)及DmNCD (登录号: X52814)的同源性也分别可达45.9%和44.9% (图1(b)). AtKP1的457~471位氨基酸序列(IFAYGQTGSGKTFTM)正好是ATP结合位点[27](图2(b)), 569~697位氨基酸序列为动蛋白的微管结合区(图2(b)). 马达区进化树分析表明, AtKP1与AtKATD 关系最近, 属于同一个进化分支(图1(b)). AtKP1氨基端108个氨基酸残基与人类微丝结合蛋白的CH结构域同源性可达 32%, 与AtKATD的也非常相似[28]. 除了马达结构域与CH结构域外, AtKP1的氨基酸序列表现出高度的特异性. 二级结构预测表明, 与传统的马达蛋白相比, AtKP1在709~749位有一个相对短的卷曲螺旋结构(图2(b)), 有可能是形成茎杆结构的部位[29].第52卷第6期 2007年3月论文2.2 AtKP1基因的表达为了确定AtKP1基因的表达模式, 从成熟植株的根、茎、叶、花、幼荚及幼苗中提取了总RNA, 用于Northern 印迹分析. 结果表明, AtKP1 在幼苗和所有被检测成熟植株各个器官中均有表达, 但是幼苗中的表达要高于成熟植株的各个器官(图3(a)).图3 AtKP1在不同器官和组织中的表达分析(a) Northern 印迹分析显示AtKP1在拟南芥植株的根、茎、叶、花、果荚均有表达, 但在幼苗中表达最强. rRNA 作为上样对照. (b) AtKP1启动子驱动的GUS基因在拟南芥中的表达: 幼苗的根和叶中均有GUS表达(1), 但主要在维管束(2, 3, 5)和幼叶表皮毛中(5); 根尖分生组织(2, 3)、成熟叶表皮毛(4)没有检测到GUS活性; 果荚和荚柄的交界处检测到少量GUS活性(6), 但果荚内部不明显. 标尺示10 µm为更进一步了解AtKP1的表达模式, 克隆了AtKP1 2.8 kb的启动子区域, 并与GUS基因融合进行转基因分析. 结果显示, 在AtKP1启动子的驱动下GUS报告基因主要在幼根维管束(图3(b), 1~3)、幼叶维管束(图3(b), 1和5)、幼叶表皮毛(图3(b), 5)以及幼嫩果荚和果柄的交界处表达(图3(b), 6), 显示AtKP1可能在拟南芥维管束和叶表皮毛的发育中发挥着作用.2.3 AtKP1 马达结构域的生化特性分析为了解AtKP1动蛋白马达结构域的生物化学特性, 在大肠杆菌中表达了带有His标签的马达结构域重组蛋白(图4(a), 2), 并通过镍柱进行了亲和纯化(图4(a), 5). 结果证明, 原核表达产物分子量约为63 kD, 与预测的分子量相一致; 免疫印迹结果显示能被动蛋白单克隆抗体所识别(图4(b)).图4 AtKP1马达结构域重组蛋白的原核表达、纯化以及免疫印迹分析(a) AtKP1 重组蛋白的表达: 1, 未经诱导的大肠杆菌蛋白质样品; 2, IPTG 诱导的大肠杆菌蛋白质样品; 3, 原核表达的可溶性蛋白; 4, 原核表达的不溶性蛋白沉淀; 5, 亲和纯化的可溶性AtKP1 重组蛋白. (b) 用动物动蛋白单克隆抗体对纯化的重组蛋白进行免疫印迹鉴定ATP 酶活性分析表明, AtKP1马达结构域表现出的自身酶活力比较低, 为17.79 ± 9.62 nmol Pi·min−1· mg−1 (图5(a), K); 但在加入微管的条件下, ATP酶活力增加到60.08 ± 17.97 nmol Pi·min−1·mg−1 (图5(a), K+Mt). 对照实验(即单独微管)没有检测到 ATP酶活性(图5(a), Mt). 这个结果表明, AtKP1马达结构域原核表达产物确实具有ATP酶活性, 且可被微管强烈激活.为了确定 AtKP1马达结构域是否能够与微管结合, 将纯化的马达结构域原核产物在非水解性ATP 类似物AMP-PNP存在的情况下与紫杉醇稳定的微管进行孵育, 然后对离心后的蛋白样品进行SDS-PAGE 分析, 结果发现AtKP1马达结构域与微管都出现在沉淀中(图5(b), 1; 箭头所示), 表明AMP-PNP能促进AtKP1与微管的结合. 然而, 当加入ATP而不是AMP-PNP时, 在微管沉淀中没有检测到AtKP1马达结构域的存在(图5(b), 3). 负对照结果显示, 没有微管时, AtKP1 重组蛋白只出现在上清中(图5(b), 5和6); 没有AtKP1重组蛋白时, 微管只出现在沉淀中(图5(b), 7和8). 上述结果充分证明AtKP1马达结构域具有依赖于核苷酸的微管结合能力.论 文第52卷 第6期 2007年3月图5 原核表达的AtKP1马达结构域具有微管激活的ATP 酶活性与微管结合能力(a) AtKP1马达结构域ATP 酶活性被微管明显激活. K+Mt, 反应系统中同时加入AtKP1重组蛋白和微管; K, 仅加入AtKP1重组蛋白; Mt, 仅加入微管. (b) AtKP1马达结构域具有依赖于核苷酸的微管结合能力. 在ATP 非水解类似物AMP-PNP 存在时, AtKP1重组蛋白能随微管进入沉淀(1); ATP 存在时, AtKP1重组蛋白没有随微管进入沉淀(3), 只出现在上清液中(4); 5和6为不含微管的负对照; 7和8为仅含微管的负对照. P, 沉淀; S, 上清3 讨论随着拟南芥基因组的测序, Reddy 等人[20]2001年根据拟南芥基因组的信息推测拟南芥中有61个动蛋白基因, 其中的6个具有CH 结构域. 当时的预测结果并没有显示T32N15.10也是一个含有CH 结构域的动蛋白基因. 而本研究通过3′-RACE 实际获得的序列证实, AtKP1对应于GenBank 预测的T32N15.10, 其N 端有一个CH 结构域, 中间有马达区, C 末端氨基酸序列不同于已知的其他动蛋白. 因此拟南芥中应该有7个具有CH 结构域的动蛋白. 马达结构域进化树的分析表明, AtKP1与动蛋白-14B 亚家族的成员AtKATD 关系最近 (图1(b)). 在这个亚家族中, 大多成员是典型的C 端马达蛋白, 但是在植物中这类家族成员的马达区也有在N 端或中间端的[30], 所以AtKP1应该属于动蛋白-14 家族, 并且马达结构域在多肽链中间的动蛋白.大多数传统的动蛋白在马达结构域和尾部区域之间都有一个相对长的卷曲螺旋, 这有助于多肽链形成二聚体[29]. 在拟南芥的61个类动蛋白中仅有3个不包含这种结构, 有些则只含有非常短的卷曲螺旋[20]. 结构预测表明, AtKP1有一个较短的卷曲的螺旋结构区域(图2(b)), 与AtKATD 和UNC-104家族中的KIF1A 和KIF1B 的结构非常相似[31,32], 因此可能是以单体形式存在. 但最近一些体外研究表明, UNC-104蛋白在高浓度“货物”存在下也有形成二聚体的倾向[33].AtKP1与AtKATD 有非常相似的结构[28], 它们的马达结构域都在多肽链的中间, N 端都有一个CH 结构域, 但是它们的表达模式却相差很大. AtKATD 在花器官中特异表达[28], 而 AtKP1在根、茎、叶、 花、荚和幼苗中均有表达, 尤其在幼苗中表达量较高(图3(a)). AtKP1启动子融合GUS 转基因研究结果表明, AtKP1主要在幼嫩器官的微管束和幼嫩的叶表皮毛中强烈表达(图3(b)). 迄今为止, 在植物中尚未发现与AtKP1有同样表达模式的其他动蛋白成员, 显示AtKP1有不同的生物学功能. 曾经有报道表明微管束与叶毛的发育机制是非常相似的[34]. 原形成层的形成起始于分生组织向原形成层细胞的分化[35], 随着茎的伸长生长, 原形成层细胞分裂并分化成木质部和韧皮部细胞, 这个过程需要细胞形状发生一个极大的变化. 与此相似, 叶毛的形成分化起始于原表皮细胞, 细胞形状也有一个极大的变化[34]. 目前我们还不知道AtKP1在维管束和叶表皮毛发育过程中的具体作用, 但从AtKP1主要定位于线粒体而不是有丝分裂微管的结果[36]来推测, AtKP1或许参与了细胞的分化而不是细胞分裂.脊椎动物动蛋白的生物化学特性已经得到大量鉴定, 证明核苷酸依赖的微管结合能力和微管激活的ATP 酶活性是传统动蛋白的主要特征, AMP-PNP 可以促进动蛋白与微管的结合[37,38]. 但从盘基网病菌(Dictyostelium discoideum )中分离的动蛋白, 在AMP-PNP 存在时却与微管的结合能力降低[39]. 植物第52卷第6期 2007年3月论文中大多数动蛋白的生物化学特性都没有得到鉴定[40]. 最近从水稻中分离出一个植物特异的动蛋白K16, 其马达结构域表现出与已知动蛋白不同的酶学特性[40]. 本研究在大肠杆菌中表达了AtKP1马达结构域, 体外活性分析表明, 它在AMP-PNP存在时与微管结合; 当加入ATP时, 则不与微管结合. ATP 酶活力分析表明, 在微管的激活下它的酶活力提高了3.37 倍(图5), 这一特点与AtKATD马达结构域的生物化学特征非常相似[28], 这可能与它们的马达结构域具有高同源性有关. 这些结果表明了AtKP1 的马达结构域与动物细胞传统的动蛋白和拟南芥动蛋白异型体AtKATD的马达结构域具有相似的生物化学特征.致谢感谢Fen Wang博士(Texas A&M University)在文章撰写过程中提供了宝贵意见.参考文献1 Grummt G M, Pistor S, Lottspeich F, et al. 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J Biochem (Tokyo), 2006, 139(4): 645—654·动 态·2007年全国生化与生物技术药物学术年会征文通知由中国药学会举办的2007年全国生化与生物技术药物学术年会定于2007年7月中旬在吉林省延吉市召开. 会议将邀请国内著名生化与生物技术药物研究专家侯云德院士、陈竺院士、陈凯先院士、陈志南教授等作专题报告. 欢迎大家踊跃投稿, 积极参会.1 征文内容(ⅰ) 生化药物的最新研究进展与展望;(ⅱ) 生物技术(基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程)药物的研究进展与展望;(ⅲ) 动植物、微生物、海洋生物活性成分(蛋白质、多肽、核酸、多糖等)及相关生物工程药物的开发的临床应用研究;(ⅳ) 特种动植物活性成分的开发应用和稀有药用植物的人工培育及替代产品的研究开发;(ⅴ) 生化与生物药物分离纯化、结构修饰、质量分析监控的新工艺、新方法和新技术;(ⅵ) 生化与生物技术药物新剂型、临床新应用的研究;(ⅶ) 生化与生物技术诊断试剂研究进展与临床应用;(ⅷ) 基因(蛋白)芯片的研究进展与临床应用;(ⅸ) 人类基因组计划(HGP)与基因医药研究开发;(ⅹ) 基因治疗与体细胞治疗;(ⅹⅰ) 人类抗体组计划、单抗隆抗体与新药开发.2 征文要求(ⅰ) 来稿应未在公开发行的期刊或全国性学术会议上发表过;(ⅱ) 综述一般不超过5000字, 研究论文不超过3000字, 并附300字以内的结构式摘要, 必须字迹清楚, 数据准确;(ⅲ) 稿件要求宋体, 4号字, 1.5倍行距; 稿件格式按《中国生化药物杂志》、《中国新药杂志》或《中国生物工程杂志》征稿要求;(ⅳ) 文稿请用E-mail提交(E-mail: shenghuahuiyi@ );(ⅴ) 稿件文责自负;(ⅵ) 投稿截止日期为2007年4月30日(以收到邮件为准);(ⅶ) 所接受的论文将录入会议文集;(ⅷ) 本次学术年会将授予参会代表中国药学会继续药学教育Ⅰ类学分5分.联系人: 王士莲王秀云电话 : (010)58051684/66094070传真: (010)58051684E-mail:*********************地址: 北京市复兴门内大街45号118信箱(100801)。
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拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建王云，任永兵，杨硕，韩宇，陶杨，曹树青(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段，再克隆到pUCm-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因。
从AtMYB61一pUCm-T载体上，用BstEII和BglII全双酶切切下目的基因片段，将此基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA2301中。
菌落PCR和酶切鉴定结果表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA2301一AtMYB61。
利用电转化法将重组表达载体导人根癌农杆菌中，获得了携带AtMYB61基因的根癌农杆菌株，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究A ￡MyB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。
关键词：拟南芥；AtMYB61基因；表达载体Cloning of Arabidopsis thaliana AtMYB61 geneand the expression vector constructionW ANG Yun， REN Yong-bing， YANG Shuo， HAN Yu， TAO Yang， CAO Shu-qing(School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)Abstract：Tota1 RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and used as the template to amplify the full length of eDNA of AtMYB6 1 gene by RT_PCR technology，and the gene fragment was subsequently cloned into plant pUCm-T vector．The results of bacterial colony PCR，enzyme analysisand eDNA sequencing confirmed that the Arabidopsis thaliana AtM YB6 1 gene was successfully cloned．AtMYB61 gene was cut completely from AtMYB61一pUCm-T vector by BstE 1]and BglⅡ，and the gene fragment was cloned into plant expression vector pCAMBIA2301．The results of bacterialcolony PCR and enzyme analysis showed the Successfu1 construction of plant expression vector pCAM—BIA2301一AtM YB61．In addition，the recombinant expression vector was carried into Agrobacterium tumefaciens by electrotransformation，and the strain of Agrobacterium tumefaciens carrying AtM YB6 1 gene was obtained．The study provides a basis for improving the resistance of transgenic plants and further exploring the molecular mechanism of AtM YB6 1 gene．Key words：Arabidopsis thaliana；AtMYB6 1 gene；expression vector0 引言随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，将外源抗逆基因导人植物的基因工程技术，在提高植物抗逆性方面具有更广泛的应用前景。
但植物的抗逆应答是一系列相关基因连续表达调控的极其复杂的调控网络。
在整个调控网络中，转录因子能调控多个相关基因的表达，所以增强转录因子的调控是提高植物抗逆性更有效的方法Ⅲ。
MYB转录因子是拟南芥中最大的基因家族。
该基因家族主要在植物的生长发育方面发挥重要作用，如植物次级代谢、信号传导、器官形成等方面[3]。
另外，也有一部分参与了逆境胁迫介导的细胞应答[4 ]。
大量研究证实，一些MYB转录因子的过量表达可以显著增加植物对逆境的耐受性L7 ]。
MYB61转录因子具有DNA结合结构域和转录调节结构域，其功能相当广泛，参与重金属、低磷和干旱等胁迫的信号调节，植物重金属胁迫与氧化胁迫是相关的【9]。
AtMYB61基因在植物中过量表达，有利于进一步研究A MyB61基因的抗逆分子机理。
因此，本文利用RT-PCR 克隆AtMYB61基因，并构建了pCAMBIA2301一At—MYB61植物表达载体，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究AtMYB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 植物材料哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株，由美国拟南芥种质资源库提供，后由本实验室繁衍，贮存。
1．1．2 主要试剂限制性内切酶Eco91I(BstEII)为Fermentas公司产品；TransTaq Polymerase High Fidelity(HiFi)为北京全式金产品；DNA凝胶纯化试剂盒、T4DNA连接酶及氨苄青霉素(进口分装)为大连宝生物公司产品；First-Strand cDNA Synthesis Kit购自上海申能博彩生物科技公司；EZ-10 Spin ColumnPlasmid Mini-Preps Kit购自BIO BASIC公司。
其它试剂均为分析纯。
1．1．3 菌株和质粒大肠杆菌DH5a由本实验室保存，农杆菌C58为中国科学技术大学提供；pUCm-T载体和pCAMBIA2301载体均为本实验室保存。
1．2 方法1．2．1 拟南芥幼苗的培养用0．1％的HgC12溶液浸泡种子3 min，去掉HgC12溶液，再用无菌水冲洗5次。
然后将拟南芥种子点种于MS固体培养基上，置于4^C冰箱中春化2 d后，转置于光照强度为100~nol／(m2·s)、22／18。
C、16／8 h光周期条件下培养14 d。
1．2．2 常规分子克隆实验技术电泳、DNA切胶回收、酶切、大肠杆菌和农杆菌感受态制备、转化、质粒提取等操作方法参见文献[1O]。
1．2．3 拟南芥AtM ，B6l基因的克隆采用Trizol法提取拟南芥幼苗总RNA。
拟南芥cDNA合成以拟南芥幼苗总RNA为模板，采用First-Strand cDNA Synthesis Kit使用说明合成cDNA。
拟南芥AtMYB61基因cDNA 的PCR扩增所用引物是根据GenBank中A￡ 61基因mRNA序列，用Primer Premier 5．0软件设计，并在上游和下游引物的5 端分别加入Bgl 1I、BstE1I酚切位点和2个保护碱基。
上游引物：5'-GA AGATCTATGC~GAGACATTCTTGCTGTT-3 ；下游引物：5'-CGC~gTCACCCTAAAGGGACTGACCA-3 。
以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5 rain，94℃变性30 S，54℃退火30 S，72℃延伸90 S，共3O个循环，72℃延伸10 min，4。
C终止反应。
PCR产物经1 9／6琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化。
拟南芥AtMYB61基因TA克隆与鉴定。
将回收纯化的A￡MYB61基因DNA，用T4 DNA链接酶与pUCm-T载体连接，再转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有100 txg／mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆。
挑取单菌落在装有1 mL的LB和1．5 mL的20／,g／mL Amp离心管中37℃下培养8～10 h。
取50 培养物，煮沸5 min，5 000 r／rain，离心2 min后，取1～2 L上清进行PCR检测。
菌落PCR 验证后的菌液抽提质粒，用双酶切(BstEU和BglII)切下目的条带，电泳检测，并回收纯化。
将经抽提质粒双酶切(BstEⅡ和BglⅡ)并做PCR鉴定后的阳性克隆菌落摇菌，菌液送至上海生物工程公司测序。
1．2．4 植物表达载体的构建(1)植物表达载体pCAMBIA2301和A￡一MYB61基因的重组。
提取AtMYB61一pUCH卜T载体，并用BstEⅡ和BglII完全双酶切切下目的基因片段，电泳检测并回收纯化。
pCMBIA2301载体用BstEII完全酶切，电泳检测并回收目标载体片段，此载体片段再用BglII部分酶切，检测并回收目标载体片段。
将该载体片段与目的基因片段用T4 DNA连接酶连接。
(2)重组表达载体导人农杆菌。
用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压2 500 kV／em；电容25 F；电阻500 Q。
电击3～5 ms后，取出电击杯，迅速加入800 L的LB液体培养基，混匀并转移至1．5 mL的EP管中，在28℃震荡培养3 h；取100／,L菌液涂布于含Gen(50／,g／mL)和Kan(50／,g／mL)的LB平板中28℃培养24 h，即可长出阳性克隆。
(3)阳性pCAMBIA2301一AtMYB61克隆的菌落PCR与酶切鉴定。
随机挑取单菌落，在装有1 mL 的LB和1．5 mL的抗生素的离心管中28℃培养12 h左右。
取5O L培养物，煮沸5 rain，5 000 r／rain离心2 min，取1～2／,L上清进行PCR扩增后电泳检测。
选取菌落PCR验证后的菌液抽提质粒，并用BstE 1I和Bgl 1I双酶切后，电泳检测。
2 结果与分析2．1 A YB61基因cDNA的PCR扩增提取拟南芥幼苗总RNA，用高保真反转录酶反转录成cDNA，再用高保真DNA聚合酶扩增A 61基因片段。
实验中所获得的目的片段与预期大小一致，CDS+酶切位点1 114 bp，两端具有相应的酶切位点，如图1所示。
2000 bp1 000 bp750 bp500bp250 bplo0 bp图1 AtMYB61基因cDNA克隆2．2 A￡MyB61基因TA克隆与鉴定目的基因与pUCm-T载体连接并将连接产物纯化，用热击法导人大肠杆菌DH5a感受态细胞中，用含100~g／mL氨苄青霉素的LB平板筛选阳性单克隆。