常用分子克隆实验方法
分子生物学实验中的克隆技术使用方法解析
分子生物学实验中的克隆技术使用方法解析克隆技术是分子生物学中常用的实验方法之一，它可以复制DNA分子，从而产生大量相同的DNA片段。
这项技术的应用非常广泛，包括基因工程、疾病研究、生物医药等领域。
本文将从克隆技术的原理、步骤和应用等方面进行解析。
克隆技术的原理是利用DNA分子的复制特性，通过PCR（聚合酶链式反应）或细菌转化等方法，将目标DNA片段复制出来。
首先，需要从源DNA中选择目标片段，可以通过限制性内切酶切割DNA，或利用PCR扩增目标片段。
然后，将目标片段与载体DNA连接，形成重组DNA。
最后，将重组DNA导入宿主细胞，使其复制并表达目标片段。
克隆技术的步骤包括DNA提取、DNA切割、连接、转化和筛选等。
首先，需要从细胞或组织中提取DNA。
DNA提取的方法有多种，包括酚-氯仿法、盐法、离心法等。
其次，需要选择适当的限制性内切酶对DNA进行切割。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并切割的酶，它们可以将DNA切割成特定的片段。
然后，将目标片段与载体DNA进行连接。
载体DNA可以是质粒、噬菌体或人工染色体等，它们能够稳定地复制和传递目标片段。
连接的方法有多种，包括DNA连接酶法、化学连接法等。
连接完成后，将重组DNA导入宿主细胞，使其复制并表达目标片段。
最后，通过筛选方法，选择含有目标片段的克隆进行进一步研究。
克隆技术在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于基因工程，包括基因的克隆、表达和改造等。
通过克隆技术，科学家可以将感兴趣的基因从一个生物体中克隆到另一个生物体中，从而实现基因的转移和表达。
其次，克隆技术也可以用于疾病研究。
通过克隆疾病相关基因，科学家可以深入研究其功能和作用机制，为疾病的治疗和预防提供理论依据。
此外，克隆技术还可以用于生物医药领域，包括药物研发、疫苗生产等。
通过克隆技术，科学家可以大规模复制目标基因，从而实现药物和疫苗的生产。
当然，克隆技术也存在一些问题和挑战。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆技术的使用方法
分子克隆技术的使用方法分子克隆技术是在分子生物学领域中最常用的一种实验方法，它可以帮助研究人员复制并分离出特定的DNA序列，用于进一步研究和应用。
分子克隆技术的使用方法主要包括DNA提取、限制性内切酶切割、连接反应、转化和筛选等步骤。
下面将对这些步骤逐一进行介绍。
首先，DNA提取是分子克隆技术的第一步，它的目的是从样品（例如细菌、植物或动物组织）中提取出目标DNA。
提取方法主要有酚/氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。
在提取过程中，我们需要将样品细胞破裂，并通过使用蛋白酶分解蛋白质，最后通过乙酸盐、异丙醇等溶剂沉淀目标DNA。
其次，限制性内切酶是分子克隆技术中的关键工具，它能够识别并切割DNA 的特定序列。
在实验中，我们选择与目标DNA序列相匹配的限制性内切酶，将其与目标DNA一起反应，酶可以精确切割DNA链，产生特定的末端序列。
这样的切割可以生成需要的DNA片段用于后续的连接反应。
连接反应是分子克隆技术的核心步骤，通过该步骤可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来。
通常情况下，载体DNA是一种循环的DNA分子，如质粒或噬菌体。
在连接反应中，我们需要将目标DNA片段与已经经过限制性内切酶切割处理的载体DNA进行连接。
连接反应可以使用DNA连接酶和缓冲液，在适当的温度下进行反应。
连接反应的最终产物是重组载体，内含目标DNA的插入片段。
然后，转化是将重组载体导入到宿主细胞中的过程。
对于大多数分子克隆实验来说，大肠杆菌是最常见的宿主细胞。
在转化过程中，我们需要将重组载体与宿主细胞共同处理，使其能够进入细胞内。
转化方法主要有热激、电击和化学法等。
通过转化，重组载体可以复制并表达其携带的目标DNA片段。
最后，筛选是分子克隆技术中的关键步骤，它可以确定是否成功克隆了目标DNA片段。
筛选依赖于所克隆目标的特性和选择的标记方法。
常用的筛选方法包括酶切鉴定、PCR扩增、限制性酶切图谱分析以及DNA序列分析等。
这些方法可以帮助我们鉴定和验证克隆的目标DNA片段是否符合预期。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆操作方法
分子克隆操作方法
分子克隆是一项常用的生物技术，用于将特定DNA 片段定向克隆到载体DNA 上，生成包含目的基因的重组DNA 分子。
以下是分子克隆的常用方法：
1. 限制酶切剪接：利用限制酶切剪配对的方式，将目的DNA 片段和载体DNA 上的相应区域进行切割，得到两个切口，然后将两个断裂的DNA 片段连接起来，形成含有目标DNA 片段的重组DNA 分子。
2. PCR 扩增：利用PCR 技术对目的DNA 片段进行扩增，并将其与载体DNA 进行连接，形成重组DNA 分子。
3. TA 克隆：TA 克隆是一种优化的克隆方法，使用缺十二碳酸二酯酶的Taq DNA 聚合酶进行PCR 扩增，将目的DNA 片段amplified 插入含有单一胞嘧啶（T）的TA 克隆载体上，然后将TA 克隆载体转化到大肠杆菌中进行筛选。
4. 原位杂交：将互补的DNA 探针标记并与目的细胞DNA 结合，发现目的DNA 片段的位置，然后将其在载体上克隆。
5. 基因文库筛选：将目的DNA 片段插入到原核或真核生物基因文库中，然后筛选出含有目的DNA 片段的重组DNA 分子。
6. 自主克隆：将目的DNA 片段插入到自主复制的质粒上，使其复制并表达出
目的蛋白质。
需要根据具体实验目的，选择适合的方法进行分子克隆，为后续的分子生物学研究提供可靠的材料基础。
分子克隆实验步骤总结
分子克隆实验步骤总结分子克隆实验步骤1.对目的片段进行pcr扩增：Pcr体系：（50μL）DNA Template：10-100ng10×PCR buffer：5μL50mM dNTPs：0.5μLPrimers：1μM eachWater：add to 49μLTaq Polymerase：1μL2.琼脂糖电泳，看有无目的条带3.对目的条带进行切胶回收4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；Taq酶，则无需加尾）加尾体系：（10μL）胶回收DNA: 8μLBuffer: 1μLdNTPmix: 0.5μLTaq Polymerase：0.5μL5.T载体连接：室温，30min体系：（6μL）加尾后产物：4μLT载体：1μLSalt solution 1μL6.30-40μL感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）9. 加SOC（200-250μL）10.37℃，300rpm，1h11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜13.试剂盒提质粒14.酶切：37℃，2h体系：（20μL）Buffer2: 2μL酶：0.5μL模板：1μLBSA：0.2μLH2O：16.31μL15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。
菌落PCR体系（20ul）10*taq buf 2uldNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM）1.6ul Primer F （10uM）0.5ul Primer R（10uM）0.5ul DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul ddH2O 12.5ul程序：94度10min94度30sec56度30sec72度2:10 30cycle 72度10min4度forever。
分子克隆法
分子克隆法
分子克隆法是一种分子生物学技术，用于在体外制备和复制DNA 分子，包括基因、DNA片段和整个染色体。
这种技术允许科学家复制和操纵DNA，以进行各种研究和应用，包括基因工程、药物开发和基因治疗。
下面是分子克隆法的主要步骤：
1.DNA提取：首先，需要从源材料（通常是细胞或组织样本）中
提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白质分离等方法来完成。
2.DNA切割：提取的DNA通常是大片段，需要将其切割成较小
的片段，以便后续克隆。
这一步通常使用限制性内切酶来实现，
这些酶可以在特定DNA序列上切割。
3.DNA连接：切割后的DNA片段可以通过DNA连接酶与载体
DNA（如质粒或病毒DNA）连接在一起，形成重组DNA分子。
这个过程称为DNA重组。
4.DNA转化：重组DNA可以被引入宿主细胞中，这个过程称为
DNA转化。
这可以通过热激冷却法、电穿孔法、化学法等方法
来实现。
5.宿主细胞培养：转化后的细胞被培养，以允许它们繁殖并扩增
重组DNA。
6.筛选与识别：在宿主细胞中，可以筛选出携带重组DNA的细
胞，通常使用抗生素抗性标记或荧光标记等方法来进行筛选。
7.DNA提取与纯化：从筛选出的细胞中提取和纯化重组DNA，
以便进一步的研究或应用。
8.分析与验证：最后，分析和验证克隆的DNA，确保它是所需的
目标DNA，并不包含错误或突变。
分子克隆法有许多应用，包括基因表达、基因编辑、蛋白质生产、疾病研究等。
它在生物学研究和生物工程领域发挥着关键作用，允许科学家操纵和研究DNA，以深入了解生命的分子机制。
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常用分子克隆实验方法I一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。
无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；(2) 高速离心去杂质。
10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；(3) 核酸吸附。
往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4) 低速离心沉淀。
5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体；(5) 75%乙醇清洗。
加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。
重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；(6) 核酸洗脱。
加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。
方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min。
(2) 氯仿抽提。
10,000rpm离心3min，取约600ul上清。
加入1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心管架上晾干5min。
(5) 溶解DNA。
加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。
取约3-5ul电泳检测后，低温冷藏。
二、植物总RNA的小量提取操作前必须对枪头，桌面等进行酒精擦洗，最好戴口罩，并及时更换手套，试剂应专用，吸头与离心管应Rnase free.方法1：离心柱法，其特点是无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，DNA污染少。
(1)充分研磨。
取植物组织材料约0.1克，加入液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后加入约500ul溶液B，继续研磨至略微粘稠的组织匀浆；(2) 高速离心去杂质。
用1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，常温下，10,000rpm离心5min，取上清（约400ul）至已充分甩干的吸附柱中；(3) 核酸吸附。
往柱中补加1/4体积异丙醇，静置3min，然后5000rpm离心30s，弃滤液，滤液较多时，宜分两次，每次15s；(4) 75%乙醇清洗。
往柱中加400ul75%乙醇，10,000rpm离心15s，弃滤液。
重复此步骤一次，再将空柱子在10,000rpm离心15s，然后将柱子直接转移至新Rnase free1.5ml管；(5) 核酸洗脱。
往柱中硅土加入45ul DEPC水，静置3min，10,000rpm离心1min，所得滤液即为RNA样品。
可取5ul通过普通琼脂糖电泳检测提取效果，样品应立即加入0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于-20℃（3个月）或-70（6个月）℃。
方法2：Trizol法，结合氯仿抽提，异丙醇沉淀。
(1)充分研磨。
取植物组织材料约0.1克，加入液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后加入约500ulTrizol溶液，继续研磨至略微粘稠的组织匀浆；或者将粉末转入1.5ml离心管，再加500ulTrizol溶液，剧烈混合1min。
(2) 氯仿抽提。
用1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，加入1倍的氯仿，振荡混匀，10,000rpm离心3min，取上清重复抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加入预冷的1倍异丙醇，混匀，10,000rpm离心5min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，横放于离心管架上，在超净台中吹5min。
(5) 溶解RNA。
加入DEPC处理过的水40-50ul，静置几分钟直至沉淀溶解，可通过普通琼脂糖电泳检测提取效果，再补充加入0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于-20℃（3个月）或-70（6个月）。
三、质粒小提方法1：碱裂解法。
(1)收获菌体。
摇过夜（12h以上）的菌液按1.5ml分装，冰浴，10,000rpm离心30s，倒掉上清，倒置或晾放于离心管架上，同时用小枪头吸走管底和盖上的残液。
(2)溶菌与变性。
加入预冷的溶液I 100ul，混合器充分悬浮菌液，冰浴。
逐管加入溶液IIA（2%SDS溶液，无需预冷）100ul，全部加完后每管补加预冷的溶液IIB（0.4MNaOH溶液）100ul，快速颠倒混合5次，随加随混，并立即放回冰浴，静置3min。
(3)去蛋白和基因组。
加预冷的溶液III（Kac溶液）150ul，用碗力轻摇10s，随加随摇，并立即放回冰浴，静置3min以上，10,000rpm离心5min（也可分两次换离心管，每次2min），吸出上清约400ul至新1.5ml离心管，冰浴。
(4)沉淀和清洗。
加入2倍体积预冷的乙醇，轻轻混匀，可立即10,000rpm离心3min，弃上清，同时用小枪头吸走管底残液。
每管轻加入1ml 75%乙醇，再吸走乙醇，并倒置或晾放5min。
(5)溶解核酸。
加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min后，取约2-3ul电泳检测，-20℃冷冻保存。
四、核酸回收与纯化方法1：溶液B柱式回收法，其特点是效率高成本低，适用于电泳和核酸溶液直接回收。
(1)溶液混合。
溶液B比例为：胶回收为3倍的胶重（毫克数）或以每小孔150ul计算；核酸溶液为3倍的体积，溶液B底限为300ul。
溶胶可采用55℃水浴3-5min或直接用混合器混合1min即可溶胶。
(2) 核酸吸附。
上柱前，往混合溶液中加入1/3 B溶液体积的异丙醇有助于提高回收率。
将混合溶液移至柱中，静置3min以上，5000rpm离心30s，若溶液较多，可分两次，每次15s。
(3) 75%乙醇清洗。
400ul75%乙醇，10,000rpm离心15s，弃滤液。
重复此步骤一次，再将空柱子在10,000rpm离心15s，然后将柱子直接转移至新1.5ml管；(4) 核酸洗脱。
往柱中滴加1/10 左右B溶液体积的双蒸水或TE(PH8.0)溶液（55℃预热效果更好），静置3min以上，10,000rpm离心1min，所得滤液即为回收核酸样品。
五、RT-PCR基本方法按照Promega试剂盒方法进行总结，融合了3’RACE技术。
逆转录阶段：（下述为20ul体系，推荐使用40ul体系）操作前必须对枪头，桌面等进行酒精擦洗，最好戴口罩，并及时更换手套，试剂应专用，吸头与离心管应Rnase free。
(1)变性与退火。
准备Rnase free 1.5ml离心管，加入：总RNA（总样品约40ul）9.5ul（一般5-10ul）；3’Race引物（60uM，1管约50ul） 1.5ul；短暂离心，70℃水浴5min，常温短暂离心，冰浴。
(2) 逆转录。
按顺序加入（成分及含量各试剂盒有所不同）：MgCl2(25mM) 4ul；10X buffer 2ul；dNTP(10mM) 2ul；Rnase Inhibitor 0.5ul；常温，轻轻混合，短暂离心，加入AMV(25u/ul) 0.6ul，45℃(MMLV只能为42℃)水浴60min。
(3) 终止反应。
在刚煮沸过的水浴（99℃）中放置5min（MMLV为70℃10min），冰浴5min，-20℃冷冻。
一般每25ul PCR体系加2-3ul作模板。
PCR阶段：。
(1) PCR体系（约25ul体系）：H (H2O) 16ul；P (Primer) 基因特异引物1ul + 3’嵌套引物1ul；B (Buffer) 2.5ul；M (Mg2+) 1.5ul；N (dNTP) 0.5ul；E (Taq) 0.125ul；T(Template) 2-3ul 逆转录产物；PCR程序为：300s 94℃；30-35个循环：94℃30s；60℃60s；72℃60-90s；300s 72℃(2)回收后再PCR。
确定目标条带出现的位置，进行回收后PCR（一般扩增两个模板梯度），同时三个对照（空白，两个单条引物），全部电泳回收，T载体连接。
六、T载体构建方法1：单酶切加T法。
(1) 质粒单酶切。
取2管各约50ul 小提的PBS质粒，分别以如下100ul体系37℃酶切6h以上（可以过夜）：PBS或其它质粒50ul；EcoRV Buffer（R+）10ul；EcoRV 2ul；ddH2O 38ul。
(2) 酶切产物回收。
以3倍体积溶液B回收200ul核酸溶液（见溶液B柱式回收法），70ul ddH2O溶解产物。
取5ul稀释至50ul，测定核酸浓度，一般要求浓度100ng/ul以上，而总量必须大于5ug。
(3) 加T反应。
回收产物加水总量为77ul，100ul体系的其余组成为：PCR buffer 10ul；Mg2+6ul；Taq(5u/ul) 5ul；dTTP（100mM）2ul。
70℃水浴2h。
(4) 产物回收及检测。
以3倍体积溶液B回收100ul核酸溶液，40ul TE（PH8.0）溶解产物。
取1ul跑电泳，2ul稀释到50ul测浓度。
控制连接时的加入量1ul左右。
七、感受态细胞制备方法1：CaCl2法。
(1) 摇菌。
从冷藏平板上挑取（或冷冻菌液中吸取）菌后可以按先小摇（10ml以下），再大摇（总体积放大10倍）的方法。
也可以直接在装有50ml或100ml LB培养基的500ml三角瓶中摇。
对于大肠杆菌，37℃快速摇，小摇过夜，大摇3h，直接摇需5－6h；对于农杆菌，培养基可简化为LB，28℃中速摇，小摇大摇均需过夜，直接摇需26-28h，中间还需添加一次利福平（Rif，20mg/ml，1/500使用）。
(2) 收集菌。
将菌液按10ml或50ml分装，冰浴5－10min。
4℃4000rpm离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上3min。
(3) CaCl2处理。
按每10ml管加1ml预冷的0.05MCaCl2，充分重悬细胞，再4℃4000rpm离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上3min。
(4) 分装。
按每10ml管加400ul（或600ul）预冷的含15％甘油的0.05MCaCl2溶液，充分重悬后，以每份200ul分装于1.5ml离心管中，4℃过夜或冻存于-70℃。