分子克隆
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
生物中的分子克隆
生物中的分子克隆克隆是指复制一个已经存在的个体或物品，分子克隆则是指复制分子。
在生物领域中，分子克隆技术极其重要，它能够让科学家们克隆出特定的蛋白质、基因和细胞等分子，不仅推动了基因工程、生物制药等领域的发展，还有助于对医学、生态学、进化论等问题的深入研究。
一、DNA的分子克隆DNA双链分子由四种核苷酸组成，克隆某个特定的DNA序列，需要寻找到该序列的特异性序列，一般采用如下方法：1.限制性内切酶切割法：将要克隆的DNA进行限制性内切酶切割，将切割后的DNA片段进行电泳分离，并用紫外线照射，使用UV灯观察DNA条带，选取符合要求的目标DNA条带作为模板，再使用电泳提取出目标DNA条带，进行下一步的操作。
2.基因库方法：将DNA切成片段后，将这些片段以随机顺序插入载体中，再将这些载体插入到宿主细胞中，寻找到目标片段所在的载体后，就可以从中将这个片段克隆出来。
通过上述方法，克隆出目标DNA后，还需要定位、测序、分析等步骤，才能够达到所需的效果。
二、基因的分子克隆基因是细胞中负责遗传物质传递的重要分子，克隆基因是基因工程活动中的一个重要环节。
1.针对已有的已知基因，可以使用上述DNA分子的克隆方法，将基因克隆出来，进行重组、改变等操作。
2.针对未知的基因，可以进行基因组测序与分析，利用反向遗传学法进行基因定位及功能分析。
3.对于人类常见疾病，例如乳腺癌、某些遗传性疾病等，深入研究它们的基因表达和调控，利用分子克隆技术进行基因治疗或转基因实验。
基因的克隆不仅促进了对于遗传学和基因学的深入研究，也能够产生特定的应用效果，甚至应用到生物治疗和治疗遗传性疾病等医学领域。
三、细胞的分子克隆细胞是生命活动的基本单位，克隆细胞可以使得相似的细胞在体外大量生长，提供研究的可操作性。
目前，主要有两种方法可以利用分子克隆技术克隆细胞：1.体外培养法：通过细胞培养基、激素等营养物质及生长因子，为细胞提供生长环境，使其在体外快速繁殖，而体外克隆细胞最广泛应用的领域就是生物制药，例如克隆出产生特殊蛋白质的细胞系，生产生物药品。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：I.引言- 分子克隆技术简介- 分子克隆技术在生物学研究中的应用II.分子克隆技术的基本原理- 分子克隆技术的定义- 分子克隆技术的基本原理III.分子克隆技术的操作流程- 准备工作- 实验操作步骤- 结果分析IV.分子克隆技术的应用实例- 基因克隆- 基因组克隆- 蛋白质表达V.分子克隆技术的优缺点- 优点- 缺点VI.分子克隆技术的发展趋势- 技术的发展- 应用领域的扩展正文：I.引言分子克隆技术作为一项重要的生物技术手段，在生物学研究中扮演着不可或缺的角色。
通过分子克隆技术，研究者可以有效地获取目标基因或DNA片段，并进行后续的分析和研究。
分子克隆技术的应用领域广泛，包括但不限于基因工程、基因组学、蛋白质组学等。
II.分子克隆技术的基本原理分子克隆技术，又称分子杂交技术，是指将目标DNA片段与载体DNA结合，形成一个新的DNA分子的过程。
这一过程主要依赖于核酸酶的切割作用，将目标DNA片段与载体DNA切割出来，并通过连接酶将两者连接成一个新的DNA分子。
III.分子克隆技术的操作流程分子克隆技术的操作流程可以分为三个主要步骤：准备工作、实验操作步骤和结果分析。
1.准备工作在进行分子克隆技术之前，需要准备以下材料和工具：目标DNA片段、载体DNA、核酸酶、连接酶、引物、模板DNA、PCR仪、离心机等。
2.实验操作步骤(1) 使用核酸酶切割目标DNA片段和载体DNA，产生相同的粘性末端。
(2) 使用连接酶将切割后的目标DNA片段和载体DNA连接成一个新的DNA分子。
(3) 将连接好的DNA分子转化到宿主细胞中，进行扩增。
(4) 提取扩增后的DNA分子，进行检测和分析。
3.结果分析通过对扩增后的DNA分子进行电泳检测、PCR验证等方法，分析实验结果，确认是否成功克隆了目标DNA片段。
IV.分子克隆技术的应用实例1.基因克隆分子克隆技术可以用于获取目标基因的DNA片段，进行后续的基因功能研究和基因编辑操作。
分子克隆
分子克隆
基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因 （外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体 外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质 粒）转入大肠杆菌体内这样重组质粒就随大肠杆菌 的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多 肽或蛋白质。
质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够
分子克隆的实验流程操作
PCR扩增目的基因 双酶切 （PCR产物， 质粒）（切） 电泳 切胶 回收
柱式纯化
菌落 转化 PCR （转，增）
连接反应 （接） 挑选阳 电泳 性菌测 序（检）
分子克隆流程示意图 质粒 抽提
（PCR扩增）
将验证反馈的 菌株保存起来
测序验证
菌落PCR
1 实验操作目的DNA片段的来源
以免穿破凝胶的底部缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到 孔外。
（5）打开电源120V，30min。
4 切胶回收
1，加3倍凝胶体积Buffer DE-A温浴75℃融化凝胶 2，加含0.5个Buffer DEA体积的Buffer DE-B
5，加入一定量 的d2H2O洗脱 3，加500 μl Buffer W1 4，加700 μl Buffer W2 加700 μl Buffer W2
1，超净工作台紫外灯10分钟。
2，把感受态细胞从-80℃的冰箱中取出放在已砸碎的冰块中5分钟。
3，取重组质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打，混匀。 4，冰浴放置30分钟。 5，再在水浴中42℃热激一般90秒钟后，再在冰中放置3分钟。 6，在超净工作台中向上述各管中分别加入1ml LB培养基（不含氨苄） 轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。 7，离心，5000rpm 1min吸取1ml上清液 8，把剩余感受态细胞涂布到含氨苄青霉素培养基上，将平板在37℃培 养箱倒置培养过夜。因为载体中含有氨苄青霉素的耐药基因，只有含质 粒的细菌能够生存，而不含质粒的细菌则死亡。
分子克隆法
分子克隆法
分子克隆法是一种分子生物学技术，用于在体外制备和复制DNA 分子，包括基因、DNA片段和整个染色体。
这种技术允许科学家复制和操纵DNA，以进行各种研究和应用，包括基因工程、药物开发和基因治疗。
下面是分子克隆法的主要步骤：
1.DNA提取：首先，需要从源材料（通常是细胞或组织样本）中
提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白质分离等方法来完成。
2.DNA切割：提取的DNA通常是大片段，需要将其切割成较小
的片段，以便后续克隆。
这一步通常使用限制性内切酶来实现，
这些酶可以在特定DNA序列上切割。
3.DNA连接：切割后的DNA片段可以通过DNA连接酶与载体
DNA（如质粒或病毒DNA）连接在一起，形成重组DNA分子。
这个过程称为DNA重组。
4.DNA转化：重组DNA可以被引入宿主细胞中，这个过程称为
DNA转化。
这可以通过热激冷却法、电穿孔法、化学法等方法
来实现。
5.宿主细胞培养：转化后的细胞被培养，以允许它们繁殖并扩增
重组DNA。
6.筛选与识别：在宿主细胞中，可以筛选出携带重组DNA的细
胞，通常使用抗生素抗性标记或荧光标记等方法来进行筛选。
7.DNA提取与纯化：从筛选出的细胞中提取和纯化重组DNA，
以便进一步的研究或应用。
8.分析与验证：最后，分析和验证克隆的DNA，确保它是所需的
目标DNA，并不包含错误或突变。
分子克隆法有许多应用，包括基因表达、基因编辑、蛋白质生产、疾病研究等。
它在生物学研究和生物工程领域发挥着关键作用，允许科学家操纵和研究DNA，以深入了解生命的分子机制。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
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黄荣桂
Fermentas China
Experience
Fermentas 总部的技术支持经常接到克隆实验相关 问题的咨询（5-6例/周）
我今天和大家介绍:
最常规的一些问题 / 原因 / 解决方案
时间安排
一个经典的克隆实验一般不会超出 2-3 天的时间
Day 1: 准备载体 & 插入子 Æ 连接 Æ 转化
样品和DNA marker保持用同样的loading buffer. 采用大小相似的条带来比较分析待测条带 如果可能，保持待测样品的上样量与所选DNA marker大致
相同。
克隆流程
准备载体和待插入的DNA
- 内切酶消化PCR产物或者质粒 - DNA 末端修饰
- 胶回收 - DNA 浓度的估算
Æ page 172 catalogue (2010/11)
pUC19 多克隆位点
Green – 同时酶切 Blue – 先切 Red – 后切
Restriction digestion: Plasmid DNA
问题: 没有或者仅仅只有部分酶切
原因: 酶的功效被甲基化封闭或者减弱了
XbaI
E.coli cells
20 – 100 ng
与载体1:1 to 1:5（摩尔比）
2 µl
2 µl 粘性末端 1u 平末端 5u 至 20 µl
孵育 10 min - 1h， 22°C（RT) 50ul 化学感受态细胞加入5 μl连接混合物 50ul 电感受态细胞加入1-2 μl连接混合物
Fermentas提供的连接酶 均带有单独包装的PEG
克隆效率根据未经紫外光照射的puc19质粒DNA的效率计算而来
DNA Quantification on a Gel
如何在凝胶上对DNA进行定量分析: MassRulerTM Express DNA Ladder Mixes
DNA Quantification on a Gel
如何在凝胶上对DNA进行定量分析:
Star activity
FastDigest® poster
Is posterio apie star activity
克隆流程
准备载体和待插入的DNA
- 内切酶消化PCR产物或者质粒 - DNA 末端修饰
- 胶回收 - DNA 浓度的估算
连接
- 建立体系 - 对照反应
转化
- 对照反应
Focus - Restriction Digestion 问题: 星活性 (relaxation of specificity)
EcoRI:
GAATTC
Star activity: T A A T T C GAATTC NAATTN
Lambda DNA + EcoRI
星活性的定义：限制酶在一些特定条件下 使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。 即可以把与原来识别的特定的DNA序列不 同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Focus - Restriction Digestion
问题: 星活性
解决方案
• 缩短孵育时间 • 不要加过量的酶
• 甘油浓度<5%(eg:Alw2II,BpiI,
Bsp68I etc对甘油敏感）
• 用纯度较高的 DNA
<25mM
• 选择合适的缓冲条件 用 FastDigest® enzymes
30 min 22°C (RT)
Focus - T4 DNA Ligase 问题: 无连接
原因: 储存不当 ¾ 冰箱温度低于-30°C. （低于 -30°C ，连接酶会开始结冰）
! 3次反复冻融后，连接酶的活性会显著降低 !
Focus - T4 DNA Ligase
问题: 无连接, ligase 有活性
Klenow Fragment: 补平 5’-突出端
(S1 Nuclease): 去掉 5’ 和 3’ 突出端
Do not use Klenow exo-
DNA End Modifications
问题: 磷酸化与去磷酸化
P
P SAP or FastAP™
PCR product
T4 PNK+ ATP
+ Polymerase: 5’ - GAATT- 3’ 3’ - CTTAA- 5’
2）酶切之后的短片段可能会在连接反应中，和插入子竞争载体，因此建 议酶切之后对PCR产物进行胶纯化处理，除去这些小分子DNA片段。
Restriction digestion: Plasmid DNA
问题: 多克隆酶切位点内的切割效率不高
/ Catalog (2010/11), page 171
16h*
Restriction digestion: PCR products
FastDigest® poster
Restriction digestion: PCR products
Day 2: 挑克隆 Æ 菌落PCR或者菌 液PCR检测阳性克隆Æ 分离 DNA Æ 限制酶消化或者测序分析
(Day 3: 从过夜培养的菌液中分离 DNA，并通过限制酶消化分析or测 序)
Final Goal
优化克隆流程可以让阳性克隆 >80%
选 5 克隆子 Æ 至少得到4个阳性克隆
克隆流程
准备载体和待插入的DNA
- 内切酶消化PCR产物或者质粒 - DNA 末端修饰
- 胶回收 - DNA 浓度的估算
连接
- 建立体系 - 对照反应
转化
- 对照反应
Restriction digestion: PCR products 问题: 切割效率低
每种限制性内切酶需要一定的保护碱基
12
Lambda DNA/Hind III DNA marker (#SM0101)
T4 DNA ligase
-+
连接:
0.5 µg Lambda DNA/Hind III fragments
1u T4 DNA Ligase 2µl 10x T4 DNA Ligase buffer 20µl final volume
Restriction digestion: Plasmid DNA
问题: 没有或者仅仅只有部分酶切
Reason: Enzyme is blocked or reduced in activity by Dam, Dcm, EcoKI or EcoBI methylation
方案:
使用不会甲基化质粒DNA的E. coli 菌株
原因: 反应混合液中含有T4 DNA Ligase的抑制剂
过量的盐离子 (>150 mM NaCl, >200mM KCl) EDTA, 蛋白, 氛, 乙醇 纯化柱上的硅胶基质 甘油 (在反应体系中不能 5%的浓度) dATP
Focus - T4 DNA Ligase Problem: No transformants, 连接酶有活性
+ P PCR product P
如果使用的是去磷酸化的载体，需确认插入子是否带有磷酸化末端
PCR 产物一般末端不带磷酸基团，需用T4 Polynucleotide Kinase （ T4多聚核苷酸激酶）磷酸化处理
Focus - Gel Extraction
问题: DNA 从胶上切下的时候，被紫外光损坏 解决方案:
Focus - Ligase Reaction 如何将载体插入子的摩尔比换算为ng？
实验例: 载体 = 6kb (20ng); 插入子 = 1kb; 载体: 插入子 = 1:3
20ng 载体 x 1kb 插入子 x 3 = 10ng 插入子
6kb 载体
1
Focus - Ligation Reaction 也可以通过 Fermentas的网络工具来计算
DNA 末端修饰
问题: 不能有效的完成DNA末端平滑化
选对DNA blunting enzyme 和方法
5'- NNN
5'- NNNNNNN - 3'
3'- NNNNNNN - 5'
3'- NNN X
5‘-overhang
3‘-overhang
酶:
T4 DNA Polymerase: 补平 5’-突出端, 去掉3’-突出端
连接
- 建立体系 - 对照反应
转化
- 对照反应
Focus - Ligation Reaction
连接反应例:
线性化载体 DNA 插入 DNA 10x T4 DNA Ligase Buffer PEG 4000 50% (用于平末端连接) T4 DNA Ligase
Water, nuclease-free
e.g.: GM2163 (可免费索取)
Genotype: F-ara-14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm-6 hisG4 rfbD1 rpsL136 dam13::Tn9 xylA5 mtl-1 thi-1 mcrB1 hsdR2
/reviewer/app
Focus - Ligation Reaction
连接效率
可通过凝胶电泳进行分析 ¾ 用含有Loading 染料的SDS混合样品 ¾ 65°C，加热10 min，点样
1 2 3M
凝胶上的连接反应产物分析示例：
M - GeneRuler™ DNA Ladder Mix 1 –DNA 插入子和载体的混合溶液
使用较长波长的紫外光 (360 nm)