分子克隆全攻略
分子克隆的基本步骤
分子克隆的基本步骤嘿，各位科学小达人，今天咱们就来聊聊分子克隆的基本步骤，这可是实验室里的“高级魔术”，我保证，听完我的讲解，你也能变成一个“DNA巫师”。
首先，得准备好我们的“魔法材料”，也就是那些瓶瓶罐罐里的“液体宝贝”。
什么“PCR试剂”、“限制酶”、“连接酶”啦，这些都是我们“克隆大业”的必备良药。
第一步，来个“DNA热舞派对”，也就是PCR扩增。
把我们的目标DNA扔进“PCR机器”里，让它跟着高温曲线一起“热舞”，直到它“子孙满堂”，复制出成千上万的DNA副本。
第二步，给DNA来个“精致修剪”，这就是传说中的“酶切反应”。
我们用限制酶这个“分子剪刀”把DNA切成我们想要的形状，这可是个精细活儿，稍微手一抖，就可能变成“DNA碎片”。
接下来，是“DNA联姻”环节，也就是“连接反应”。
我们把修剪好的DNA片段和载体DNA“牵线搭桥”，让它们在连接酶的“见证”下，成为“一家人”。
这就像是在实验室里举办了一场“分子婚礼”。
然后，是“细胞变身”时间，也就是“转化反应”。
我们把连接好的DNA“送入”细菌细胞，让它们变成“DNA搬运工”。
这个过程就像是在细胞界搞了一场“特工行动”。
紧接着，得来个“D NA身份验证”，也就是“筛选转化子”。
我们把这些“可能怀孕”的细胞放在含有抗生素的培养基上，只有那些成功“怀孕”的细胞才能存活下来，这就像是在玩“细胞版”的“谁是卧底”。
最后，我们要进行“DNA产前检查”，也就是“DNA测序”。
通过测序，我们可以确认我们的克隆是否“健康成长”，没有出现“基因突变”这类“家庭悲剧”。
总之，分子克隆这事儿，听起来高大上，其实就是一场实验室里的“魔法表演”。
只要掌握了这些“咒语”和“魔法棒”，你也能在DNA的世界里，玩转“克隆大法”。
别忘了，每个科学家心里都住着一个小巫师，分子克隆，只是我们施展魔法的一部分！。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法I一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。
无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；(2) 高速离心去杂质。
10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；(3) 核酸吸附。
往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4) 低速离心沉淀。
5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体；(5) 75%乙醇清洗。
加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。
重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；(6) 核酸洗脱。
加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。
方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min。
(2) 氯仿抽提。
10,000rpm离心3min，取约600ul上清。
加入1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心管架上晾干5min。
(5) 溶解DNA。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
分子克隆流程
分子克隆流程分子克隆呀，就像是一场微观世界里的神奇魔法。
咱先说说这第一步，得把目标基因给找出来。
这就像是在基因的大森林里找一棵特别的树。
有时候这基因藏得可深了，你得各种找线索，像是基因的一些独特的小标记之类的。
找着找着，突然发现目标基因的时候，那感觉就像是找到了宝藏一样，心里可美了。
接着就是获取这个基因啦。
这就好比把找到的宝藏小心翼翼地挖出来。
有好多种方法呢，像从生物的基因组里直接切出来，这个过程就像是用一把超级小的剪刀，精准地把想要的那部分基因剪下来。
或者用一些其他的巧妙手段，像是从mRNA反转录得到，就像是照着一个影子重新做出实体一样。
再之后就是把这个基因放到一个载体里。
载体就像是一个小飞船，要带着基因去一个新的地方。
这个过程可不能马虎，就像把宝贝小心翼翼地放进一个小盒子里，还得保证放得稳稳当当的。
而且这个载体还得是经过精心挑选的，就像给宝贝选一个最合适的运输工具。
然后就是把带着基因的载体送到宿主细胞里。
宿主细胞就像一个小房子，这个时候就像是把带着宝贝的小盒子送到一个新的家里。
这个送的过程也得很小心，要让载体顺利地进入细胞，不能把这个小房子给弄坏了。
等基因进入宿主细胞后呀，还得检查一下到底有没有成功呢。
这就像是检查宝贝有没有在新家里安顿好。
用一些特殊的方法，像是看基因有没有表达出特定的东西。
如果成功了，那就像一场精心策划的旅行完美收官，心里别提多开心了。
要是没成功呢，也别灰心，就像一次小冒险失败了，再重新来一次就好啦。
分子克隆就是这样一个充满挑战又特别有趣的过程，每一步都像是在微观世界里的一次奇妙探索呢。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
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分子克隆一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的量，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10*buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。
（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。
1ul量太少，可以加将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。
6ul 15000bp的maker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。
可对比maker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于连接反应的用量。
Image J软件可以做灰度分析。
）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。
回收完之后用同样的方法分析其浓度。
（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。
）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16°连接12-16h。
载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3~1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。
扫胶的电脑上有个文件：连接反应.xls，按要求填写即可得出连接反应的用量。
因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。
如果时间比较紧张，可以25°连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul 16°继续连接。
三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70°中取出感受态，在手心融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，混匀。
冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。
然后立即插入冰上，静置2min。
（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。
）在超净台中加入700ul LB培养基，然后37°摇床培养45min-1h；4000rpm离心3min，在超净台中弃去700ul上清，然后轻轻吹打残留的菌液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精灯上烧热灭菌，后冷却）37°培养箱先正放15min，之后倒置培养12-16h。
（超过16h，则阳性克隆周围会生出卫星菌落，原因是阳性克隆会分泌水解氨苄的酶到培养基中，水解其周围的氨苄，因此，平板上的DH5α、杂菌等会生长。
）四、重组子的挑取培养挑选单克隆到2ml LA培养基中，37°培养8-16h，可提质粒。
（要在管壁上部用注射器的针头烧热，戳个小洞，因为大肠杆菌是好氧的，无菌会生长缓慢）其实在挑克隆培养的时候就可以PCR鉴定，先配好PCR反应体系，在超净台中，同一个克隆，一半用于摇菌培养，一半用小的枪头挑取在对应的PCR体系里涮一下，即可作为模版进行PCR反应。
PCR时要做阴性、阳性对照；阴性对照，用枪头在没有菌落的培养基上沾一下做模版（PCR灵敏度很高，要排除连接体系中的残留的DNA对结果影响的可能），阳性对照用最初PCR扩增DNA片段时的模版。
也可以等37°培养8-16h之后取1ul菌液做模版鉴定，或者提质粒之后，用质粒做模版进行鉴定，均可。
五、质粒的提取与电泳检测1.在超净台中取300ul菌液与无菌EP管中，4°保存，待鉴定是否成功后取100ul菌液+100ul 50%甘油保种，送200ul菌液到公司测序，不正确的丢掉即可。
（如果质粒量很多，也可以送5-10ul质粒测序）2.取1ml菌液到新的EP管, 12000 rpm离心30s，弃上清，再将700ul剩余菌液于同一EP管，12000 rpm离心30s，弃上清。
然后瞬时离心，将残留液体吸干。
（枪头不能重复使用）3.加入预冷的100µl 溶液I。
反复吹打混匀。
（一定要混匀，不然会影响裂解效果，可以用涡旋混合器震荡混匀）4.加入200µl溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次。
（不要剧烈震荡，防止基因组DNA、质粒断裂，可以悬空加试剂，这样不用换枪头，而且比较快，下同）5.观察到溶液变清后，立即加入预冷的150µl 溶液III。
颠倒3-5次，颠倒时用手指轻弹离心管底部，混匀。
冰浴5min。
12000rpm离心10min。
6.取400ul上清至另一干净的离心管中（尽量不要吸到白色的沉淀物质，如果效果不理想，可以转移400ul上清至新离心管，12000rpm，5min，之后在转移上清），加入280µl异丙醇，充分混匀。
室温放置2min，12000rpm离心10min。
7.弃上清，加入1ml 75%的乙醇，轻轻颠倒两次，12000rpm离心5min。
8.弃上清，然后瞬时离心，用Tip头将残留酒精吸干。
空气中干燥10min。
9.加入25ul 含有RNA酶的ddw溶解质粒。
（RNA酶溶液：取10ul RNA酶，加990ul ddw）10.取1ul质粒，加9ul ddw，2ul 6*loading buffer，混匀电泳检测质粒浓度。
六、酶切鉴定或者PCR检测大约酶切1ug质粒进行鉴定。
如果质粒含量太少，即便能够切下目的条带，也有可能看不到。
（为了节约，鉴定时取0.25-0.5ul的酶，20ul体系，酶切30min-1h，即可电泳跑胶）PCR检测，则将提取的质粒稀释10-100倍到适合做模版的浓度（taq酶的说明书上有说明），利用目的片段的引物，使用普通的taq酶PCR即可。
注意事项：1.移液器使用结束后调回最大量程放归远处。
2.本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。
3.不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。
而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。
取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。
4.Ep管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。
5.制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。
制胶时要除去气泡。
拔梳子时要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。
6.上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。
也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
7.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害，对眼睛尤甚。
观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜或眼罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。
割胶回收动作要快，避免紫外照射时间过长，使得DNA突变。
8.实验中注意更换枪头，以避免试剂的污染，悬空滴加试剂的话，可以连续使用。
碱裂解法质粒提取的原理溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。