第五章+核酸分离与纯化技术

溴化乙锭（EB）
（一）核酸的鉴定
2.纯度分析 （1）紫外分光光度法---A260/A280比值 通常：纯的DNA A260/A280=1.8
纯的RNA A260/A280=2.0
污染：DNA A260/A280﹥1.8 提示有RNA污染 ﹤ 1.8 提示有蛋白质或酚的污染
（一）核酸的鉴定
2.纯度分析
提取DNA的原则
纯度
尽量去除生物样本中 除核酸以外的其它分 子物质，保证提取核 酸的纯度。
完整
尽量简化操作步骤， 减少各种破坏核酸的 有害因素，保证提取 核酸的完整性。
提取DNA的原理
溶解细胞膜和核膜，释放核蛋白，并使DNA与组蛋白分离； 去除生物样本中的蛋白质和RNA，沉淀获得基因组DNA； 去除残留的试剂，从而获得具有一定纯度的DNA样品
1. 碱裂解法
• 细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和 染色体DNA形成大的复合物
• 这些复合物在高钾盐条件下沉淀，经离心分离，质粒 DNA保留在上清液中
• 直接用无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的乙醇洗涤。 • 当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构
1.碱裂解法
2. 硅胶膜柱抽提法
低温保存 缓冲液 避免反复冻融 小量分装
（二）核酸的保存
1.DNA的保存 溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。 TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低于
7.0时DNA易变性。
2. RNA的保存
• RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃ 保存
DNA分子 DEAE纤维素膜，低盐下洗去杂质，高盐条件下析出DNA分子 不适合用于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收
单链DNA
2．电泳洗脱法 含有两个主要步骤： 1、将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入 一个便于回收的小容积溶液中 2、分离纯化出DNA片段。 该方法很不方便，而且不适合同时回收大量不同的
一、基因组DNA的分离与纯化
（一）酚抽提法 （二）硅基质膜吸附法 （三）玻棒缠绕法
（一）酚抽提法——流程示意图
（一）酚抽提法
（二）硅基质膜吸附法
（三）玻棒缠绕法
两个关键步骤： 1、基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交
界面 2、将沉淀的DNA缠绕于带钩玻璃棒上，通过代
购玻璃棒将高分子量DNA沉淀从乙醇溶液中转移到 PH8.0的TE溶液重悬。
（二）柱分离法
• 硅基质膜吸附 • 阴离子交换树脂 • 磁珠
小结
1.核酸分离纯化的基本原则 2.核酸分离纯化的技术路线 3.核酸的鉴定与保存 4. 基因组DNA的分离纯化 5. 质粒DNA的提取与纯化 6. RNA的分离纯化
• RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间 • 用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理
第二节 DNA的分离与纯化
DNA的理化性质
• DNA为白色纤维状固体； • 很长的线性分子，容易断裂； • 在溶液中粘度较大，沉淀后较难溶解； • 含有磷酸基团、碱基，可两性解离； • 磷酸基团的酸性很强， pI较低。
非需要的核酸分子
对后续实验有影响的试剂
三、技术路线
3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤
✓浓缩----沉淀是最常用的方法 ✓沉淀----有机溶剂法
乙醇、异丙醇、聚乙二醇等
✓洗涤----70%~75%的乙醇（去除盐）
四、样品鉴定与保存
（一）核酸的鉴定
✓完整性
✓浓度
核酸鉴定
凝胶电泳
紫外分光光度法 & 荧光光度法
核酸
DNA
蛋白质
核蛋白
RNA
一、标本
-血液 - 唾液
- 尿液
常见标本
- 组织及培养 细胞
二、方法和试剂的选择 （一）选择原则
＊保证核酸一 级结构的完整 性。
＊尽量排除其 他分子的污染， 保证其纯度。
二、方法和试剂的选择
（二）方法和试剂
＊pH 控制pH在4.0~10.0 ＊温度 避免高温，核酸提取一般在0℃-4 ℃ ＊酶 避免DNA酶对DNA的降解
基因组DNA提取结果电泳图
二、质粒DNA提取与纯化
共价闭环DNA分子
质粒DNA的三种构型: 半开环DNA分子
线性DNA分子
二、质粒DNA提取与纯化
（一）质粒的小量抽提
• 碱裂解法 • 硅胶膜柱抽提法
• 其他方法
1. 碱裂解法
在强碱（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁 和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质 粒DNA。
（一）异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法
试剂及作用： 1、异硫氰酸胍：强蛋白变性剂 2、β-巯基乙醇、DTT：破坏Rase中的二硫键 3、酚氯仿：蛋白变性剂，加速分相 4、异戊醇：消除抽提过程中因蛋白变性产生的泡沫
（一）异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法
总RNA产量取决于标本的起始量，每mg组织大 约能制备4～7µg总RNA，每106个细胞大约能制备 4～10µg总RNA。
1、血Hcg的——亚基与FSH和LH的亚基相似 2、正常妊娠过程中，血Hcg在第——周达到高峰 3、血中AFP高于——对诊断原发性肝癌有帮助 4、滋养层细胞瘤和绒毛膜上皮细胞癌的标志物是——
核酸分离与纯化技术
章节内容
1
核酸的分离与纯化技术
2
DNA的分离与纯化
3
RNA的分离与纯化
第一节 核酸的分离与纯化技术
• 通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收 上清液中的质粒DNA
2. SDS裂解法
• 将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处 理以破坏细胞壁
• 用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中 • 用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA
二、质粒DNA提取与纯化
（三）质粒的鉴定
避免RNA酶对RNA的降解 ＊尽量简化分离纯化步骤
三、技术路线
细胞裂解
核酸分 离纯化
浓缩、沉淀 与洗涤
三、技术路线
1.细胞裂解 破碎细胞
机械法
液体剪切法 固体剪切法
非机械法
干燥法
✓溶胞法 ：化学试剂、酶 （方法温和）
三、技术路线
2.核酸的分离与纯化
细胞裂解物
复杂混合物
提取核酸
去除污染 非核酸的大分子污染物
（二）质粒的大量抽提
• 煮沸裂解法 • SDS裂解法
1. 煮沸裂解法
将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中， TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞， 并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。
1. 煮沸裂解法
• 质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重 新恢复其天然超螺旋结构
28S RNA 荧光强度为18S RNA的2倍
降解： DNA 电泳图呈拖尾状
RNA 总RNA特征性区带荧光强度改变
（一）核酸的鉴定
完整DNA电泳图
降解DNA电泳图
（一）核酸的鉴定
真核生物RNA电泳的三条特征性区带
四、样品鉴定与保存
（二）核酸的保存 1.DNA样品的保存 2.RNA样品的保存
（二）核酸的保存
（2）荧光光度法----用EB等荧光染料示踪核酸电泳
通常：纯的DNA 分子较RNA大，迁移率低 纯的RNA 总RNA有三条特征性区带
污染：有杂带
凝胶电泳 & 荧光光度法
（一）核酸的鉴定
DNA电泳
RNA电泳
（一）核酸的鉴定
（一）核酸的鉴定
3.完整性鉴定：凝胶电泳法 完整：
DNA 分子较RNA大，迁移率低 RNA 总RNA有三条特征性区带
DNA片段。
3．低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收DNA的凝
胶块
（四）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段
• 标准方法是压碎与浸泡法 • 将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎 • 以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。
第三节 RNA的提取与纯化
一、RNA提取的特殊要求
• 凝胶电泳法
质粒的鉴定
质粒DNA提取结果电泳图
三、DNA片段的回收
（一）DNA样品的进一步纯化 纯化的方法包括 •透析 •层析 •电泳 •选择性沉淀等
（二）总的原则与要求
• 一是要提高DNA片段的回收率；
• 二是要去除回收DNA样品中的污染。
（三）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
1．DEAE纤维素膜插片电泳法 DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的
✓纯度
（一）核酸的鉴定
1.浓度测定 （1）紫外分光光度法 核酸分子在260nm有最大吸收峰
当A260=1 OD时
C双链DNA = 50μg/ml C单链DNA = 40μg/ml C单链RNA = 40μg/ml
（一）核酸的鉴定
1.浓度测定 （2）荧光光度法
荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入核酸 碱基平面，可使核酸分子在紫外线照 射激发下发出橙红色荧光。
• 以硅基质作为填充材料的柱层析，依靠DNA与硅基质 的可逆性结合来进行纯化
• 在多盐条件下，DNA吸附到硅基质 • 以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖类等生物大分子 • 加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通过离心
洗脱出来。
3. 其他方法
• 小量一步提取法 • 牙签少量制备法
二、质粒DNA提取与纯化
1.避免细胞外Rase污染
2.抑制细胞内Rase活性
• 空气
实验室环境
• 操作者 手套与口罩
• 实验器材 一次
二、RNA的提取与纯化
（一）Trizol试剂提取法 （异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法） （二）柱分离法