transwell实验原理与步骤
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。
常用0.4、3.0μm。
我们实验室用的是0.4μm。
将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
(完整版)transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1、无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜:用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。
2、有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 µl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。
但这一步并不就是必须的。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。
个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
transwell共培养原理
一、Transwell共培养介绍Transwell共培养是一种常用的体外细胞培养技术，通过使用Transwell孔膜插入式细胞培养皿，可以模拟细胞间相互影响的情况，从而更好地研究细胞间信号传导、细胞迁移和细胞间相互作用等生物学过程。
本文将结合Transwell共培养的原理、应用和操作步骤，对该技术进行详细介绍。
二、Transwell共培养的原理Transwell共培养的原理是利用Transwell孔膜插入式细胞培养皿，使得上下室中的细胞可以通过孔膜进行相互作用。
孔膜的直径通常在3-12微米之间，可以根据实验需要选择不同直径的孔膜。
上下室中的细胞可以分别种植在孔膜的两侧，从而实现细胞间的共培养。
三、Transwell共培养的应用1. 模拟体内细胞间相互作用：Transwell共培养可以实现不同类型细胞之间的相互作用，如免疫细胞与肿瘤细胞、上皮细胞与间质细胞等，从而更好地模拟体内情况。
2. 研究细胞迁移和浸润：通过在孔膜上涂覆ECM或采用Transwell迁移实验可以模拟细胞的迁移和浸润过程，对细胞迁移机制进行研究。
3. 评价药物渗透性：可用于评价药物在肠道、肾小球等组织中的渗透性，以预测其在体内的分布和代谢情况。
四、Transwell共培养的操作步骤1. 准备Transwell孔膜：选择合适直径的Transwell孔膜，并在使用前进行灭菌处理。
2. 细胞培养：分别将上下室的细胞分别种植在Transwell孔膜的两侧。
3. 培养条件：放置Transwell共培养皿于细胞培养箱中，保持适宜的pH值和温度，并定期更换培养基。
4. 实验操作：根据实验的目的，可进行细胞迁移实验、信号传导实验等操作。
5. 结果分析：对实验结果进行统计分析，观察上下室细胞的形态及细胞指标的变化。
五、Transwell共培养技术的发展趋势随着生物医学研究的不断深入，Transwell共培养技术也在不断发展。
未来，Transwell共培养技术有望应用于疾病模型的构建、靶向药物筛选等领域。
transwell细胞迁移实验
Transwell细胞迁移实验引言细胞迁移是生物学研究中的重要内容之一，也是许多疾病研究的关键环节。
在许多生物学实验中，研究人员需要测量和评估细胞的迁移能力。
而Transwell细胞迁移实验就是其中一种常用的方法。
本文将介绍Transwell细胞迁移实验的原理、实验步骤以及数据分析。
原理Transwell细胞迁移实验是通过将细胞悬浮液放置在Transwell膜上，然后观察和测量细胞通过膜的能力来评估细胞迁移能力。
该实验通常使用腔体作为细胞迁移的模拟环境，而Transwell膜则起到筛选和隔离细胞的作用。
Transwell膜由许多孔隙组成，孔隙的直径可以根据实验需求设置。
当细胞悬浮液被加入到Transwell膜的上腔时，由于细胞迁移能力，部分细胞将穿过膜孔和底腔进入下方。
通过对底腔中的细胞数量进行计数或测量，可以确定细胞的迁移能力。
实验步骤1.准备细胞悬浮液：将需要研究的细胞培养至对数生长期，用PBS缓冲液洗涤细胞，然后用适当的培养基保持细胞的活力。
2.调整细胞浓度：将细胞用培养基稀释至适当的细胞数目，一般为10000-50000个细胞/mL。
3.准备Transwell膜：将Transwell膜放入装有培养基的96孔板中，静置30分钟使其和培养基充分接触。
4.加入细胞悬浮液：将步骤2中的细胞悬浮液加入到Transwell膜的上腔中，确保每个孔都有足够的细胞数量。
5.添加诱导剂：如需研究细胞对特定诱导剂的迁移能力，可以在底腔中加入含有诱导剂的培养基。
6.孵育细胞：将装有Transwell膜的培养板放入培养箱中，根据实验需求进行孵育。
通常孵育时间为6-24小时。
7.细胞固定和染色：孵育结束后，用PBS缓冲液轻轻地洗涤Transwell膜上的细胞，然后用适当的方法固定细胞并染色。
8.细胞计数：使用显微镜观察并计数Transwell膜底部的细胞数量。
可以根据需要选择不同的显微镜放大倍数。
数据分析通过Transwell细胞迁移实验得到的数据可以用于评估细胞的迁移能力，并进行相关的统计分析。
(完整版)Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
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一、Tran swell 小室制备1. 无基质胶Tran swell 小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。
另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Tran swell 小室制备Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
三、接种细胞①取细胞悬液100 —200 加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。
24孔板小室一般200卩l。
②24孔板下室一般加入500 □含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。
这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③培养细胞：常规培养12 —48 h (主要依癌细胞侵袭能力而定)。
时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。
我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。
用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。
所以，用这个浓度来做Tran swell , 处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。
时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。
同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。
时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。
另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。
因此，个人建议，最好接种细胞后1—2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
四、结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：1. 直接计数法(1)"贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。
通过给细胞染色，可在镜下计数细胞①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞②染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台？蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。
个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1).不需要固定细胞，直接染色即可。
(2).配制简单方便。
(3).染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570 nm 测其OD值，间接反映细胞数。
个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。
因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。
使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
③细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Tran swell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。
也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。
取若干个视野计数细胞个数。
论坛里一般采用3-5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。
我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。
我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon 公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。
不同厂家不同型号的小室，膜的面积不尽相同，但个人认为，拍照时还是应当选取固定的位置，并选择尽可能多的视野。
(2 ) “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。
这种情况我没有遇到过，根据论坛里提供的经验，可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数，个人认为MTT应该也是可以用的，有兴趣的可以试试看。
2. 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。
(1) MTT 法①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞②24孔板中加入500 □含0.5 mg/ml MTT 的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37 C 4 h后取出。
③24孔板中加入500卩l DMSO将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10 min , 使甲？充分溶解。
取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
(2 )荧光试剂检测这类方法一般是与Tran swell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。
Chemicon的ECM554即属于这类。
(3)结晶紫检测上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。
但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。
1. 1Matrigel : Becton Dick in son Compary, - 20 C 保存；Tanswell plate : Costar ,USA , # 3422 , 聚碳酯膜微孔直径为8 ^m ;苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1.2 趋化因子的制备取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次；加入无血清培养基，37 C ,5 %CO2培养24 h〜48h，收集细胞培养上清；4 C ,12 OOOrpm 离心,10 min ,取上清；0.22卩m滤膜过滤除菌；分装，在-20 C保存。
1. 3transwell培养板准备所有操作均需无菌操作。
-20 C保存的Matrigel在冰上保2 C〜8 C过夜融化。
在冰上用预冷的枪头吸取100卩l Matrigel加入冰预冷的300卩l无血清培养基中,充分混均。
取上述稀释的Matrigel 25 卩加入transwell板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37 C ,30 min ,使Matrigel聚合成胶。
已铺好Matrigel的transwell培养板置于37 C可保存2周。
1.4Matrigel侵袭实验（Matrigel Invasion Assay）刺激后的各组细胞用PBS漂洗3次。
以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 M05个细胞/ ml，每组细胞各分为两部分。
胎盘兰拒染实验，细胞活力需大于95 % oTranswell培养板上室加入100卩l细胞悬液（5 104个）并加入无血清培养基200 ul。
Tran swell培养板下室加入500卩l趋化因子,37 C ,5 %CO2 培养24 h。
用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。
小心取出上室，用线拴住,并做好标记，用冰预冷的甲醇固定30 min。
苏木素染色1 min。
梯度乙醇脱水（80 % ,95 % ,100 %）,二甲苯透明。
小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，置载玻片上中性树脂封片。
附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下（400）随机取6个视野［1 ］计数，取平均数。
重复实验两次。
2. 1NIH3T3细胞制备的趋化因子与胎牛血清趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子［2 ］。
目前利用NIH3T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多，时间较长且实验步骤繁琐。
众所周知，胎牛血清中有趋化因子，我们在不同浓度TNF a刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的，两组迁移的细胞数很接近。
在实验时间上，用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1周，而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为 2 d ,实验时间节省了很多。
因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3细胞制备的趋化因子。
2. 2 细胞的准备所需细胞应处在对数生长期，细胞活力需大于95 %。
如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降，影响实验结果。
2. 3 擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞先用干棉签将上室内液体吸去，再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞，如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞，在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。