体外放射配体结合分析
受体与配体结合试验的测定方法
受体与配体结合试验的测定方法直接测定法：1. 放射性同位素法（Radioligand Binding Assay）：这种方法通过使用放射性同位素标记的配体来测定受体与配体结合的情况。
标记的配体包含一种放射性同位素，如3H或125I。
实验中，将放射性标记的配体加入到含有受体的体外反应体系中，然后通过测定结合与非结合配体的量来计算受体与配体的结合亲和力。
这种方法常用于研究受体的亲和力、结合位点及受体的浓度。
2. 荧光共振能量转移法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）：FRET基于两个荧光标记的分子之间的能量转移。
通过在受体和配体的分子中标记荧光染料，并在荧光染料的发射和捕获波长上进行测量，可以确定受体和配体之间的相互作用及结合状态。
这种方法的优势是能够在活细胞或组织中进行实时监测。
间接测定法：1. 生物活性测定法（Bioassay）：这种方法通过研究受体与配体结合后的生物学效应来间接测定受体与配体的结合情况。
例如，可以通过测定细胞增殖、酶活性、信号传导通路等生物学效应来评估受体与配体之间的结合情况。
这种方法的优势是可以直接测定受体配体的生物学活性，但缺点是无法精确测定结合亲和力。
2. 反应动力学分析法（Kinetic Analysis）：这种方法通过测定受体与配体结合过程中的动力学参数来间接测定结合情况。
例如，可以使用BIAcore系统等生物传感器技术来实时监测受体和配体之间的结合和解离过程，并从中得到结合速率常数、解离速率常数等动力学参数。
这种方法的优势是可以测定结合反应速率和平衡常数，但需要专门的仪器设备。
此外，还有一些衍生的测定方法，如表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、放大荧光极化法（Amplified Fluorescent Polarization Assay, AFP）等，这些方法广泛应用于生物医学研究中。
放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法
竞争曲线
固定的放射性配基浓度，一定量的受体和 不同浓度的未标记化合物
数学表达
此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受 体的能力。通常用IC50和Ki来表示。
闪烁液
包括溶剂、闪烁剂和添加 剂 溶剂：溶解闪烁剂和放射 性样品，吸收和传递射线 能量。 闪烁剂：第一闪烁剂（吸 收受激溶剂能量，退激发 光）、第二闪烁剂（波长 转移，匹配光电倍增管光 谱；提高淬灭耐受） 添加剂：助溶剂、抗淬灭 剂
α2
M
Rauwolscine
阿托品
3H-Rauwolscine
3H-QNB（毕兹） 3H-DHA
大鼠皮层
大鼠脑去小脑/回肠
β
心得舒
鸭红细胞/大鼠脑
RBA的安全问题
β射线
天然放射现象
放射型物质发出的射线有三种：
三种射线
α射线 β射线 γ射线
α射线
根据射线的偏转方向和磁场方向的关系可以 确定，偏转较小的一束由带正电荷的粒子组成， 我们把它叫做 α 射线， α 射线由带正电的 α 粒子组 成 . 科学家们研究发现每个 α 粒子带的正电荷是电 子电荷的2倍，α粒子质量大约等于氦原子的质量. 进一步研究表明α粒子就是氦原子核. 由于α粒子的质量较大，所以α射线的穿透本 领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住.
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析 （radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
核医学体外放射分析技术课件
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
第8章 体外放射分析技术新版
抗体包被分离法
特点：试管包被第二抗体 原理：SP－Ab2－Ab1－*Ag
Ab2
优点：固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等， 有逐渐取代液相法的趋势。
固相吸附分离法
吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。活性 炭是常用的吸附剂，多用于小分子游离抗原和抗原－抗体复合物的分 离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合 物，这样在活性炭的表面形成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种 特殊颗粒时，小分子的游离抗原就会被活性炭吸附，从而达到分离B 与F的目的。
逐个代入上式，即可求得各样品的含量 X。 优点：操作简单，用计算器也可拟合。
缺点：①由于Log 0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度②
如有突出值，整条拟合线会偏离；③在顺序加样法中不是 直线不可用。
2. 四参数Logistic模型 本法从Logit-Log法演化而来，其函数式如下： Y=（a-d）/「1+（X/C）b」+d 式中Y是标记抗原在各实验点的结合率（包括NSB），X 是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时
1、系统误差（systematic error）这种误差常表现为检测结果呈 倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法 误差，如标准品稀释体积不正确；抗体过浓或过稀，分离效果不 好；不适当的曲线拟合模型等。（2）仪器和试剂误差，如仪器状
态不佳；量器不准；试剂不纯等。（3）操作误差，如不正确的操
作习惯、错加样品等。系统误差是可以通过努力消除的。 2、随机误差（random error）这种误差是由难以确定且无法控
制的原因（偶然因素）引起，误差的出现是随机的，与真值的偏
实验核医学-体外分析技术
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
体外放射性分析
定义：在体外条件下、以放射性核素标记的配体为示踪剂、以结合反应为基础、以放射性测量为定量手段、对微量物质进行定量分析的一类分析方法。
按照方法学设计原理分类竞争性结合分析——竞争性结合反应为基础，结合剂和标记物是限量的。
（放射免疫酶促受体）放射免疫分析（最有代表性）、放射受体分析、蛋白质结合竞争分析、放射酶促分析非竞争性结合分析——结合剂的结合位点是过量的，待测配体全量参加反应，灵敏度高。
免疫放射分析、受体放射分析、酶的放射化学测定、酶的激活剂或者抑制剂测定。
※共同基础为分子识别。
放射免疫分析(RIA)——待测抗原和定量标记抗原与有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为定量手段，获得待测抗原浓度的分析。
条件1、待测Ag和标记具有相同免疫活性。
2、待测Ag和标记Ag*总量必须＞Ab量（只有多了才能竞争）3、Ag*量和Ab量保持恒定。
4、Ab必须有合适的滴度（常以能与50%标记抗原结合的稀释倍数表示）5、降低Ab浓度→提高检测灵敏度，但是缩窄检测范围6、增加Ab浓度→降低检测灵敏度，但是适合较高浓度的抗原检测。
公式：（Ag+Ag*）＋Ab——→Ag·Ab + Ag*·Ab + Ag + Ag*免疫放射分析（IRMA）——过量的标记抗体与待测抗原结合，分离标记抗原抗体复合物和未结合标记抗体，通过反射性测量可求得抗原的含量。
Ag+＋*Ab——→Ag·*Ab + *Ab具体方法：单位点法、双位点法（应用最最多的方法）和标记第三抗体法两种方法异同点相同点：1、均已抗原抗体的免疫反应为基础；2、测定的对象都是物质的抗原不同点：见下表受体放射分析——研究受体数目和性质的分析技术，非竞争性结合分析受体放射分析时标记配体的要求：1、与相应的受体有高亲和力，在一定浓度达到最大结合率，转移性好；2、标记配体比活度高（＞10ci/mmol），纯度高、常用的多为3H标记拮抗剂，某些具有酪氨酸残基的多肽也可以125I标记。
放射性配体与受体结合分析实验方法
放射性配体与受体结合分析实验方法放射性配体与受体结合分析方法（Radioligand Binding Assay，RBA）是一种常用的生物化学实验方法，用于研究受体与其配体之间的结合亲和性和数量。
该方法通过标记配体的放射性同位素来实现，可以精确测定受体与配体之间的亲和力。
RBA方法的原理是将受体样品与放射性标记的配体一起孵育，使二者发生结合。
非结合的配体随后通过洗涤的步骤去除，然后测定剩余的结合复合物中的放射性信号。
根据放射性信号的强度，可以计算出受体与配体结合的比例和结合亲和力。
RBA方法需要一些实验材料和设备，包括放射性标记的配体、受体样品、未标记的配体（用于测定非特异性结合）、放射性检测设备（例如放射计或闪烁计数器）以及用于孵育和洗涤的缓冲液。
实验步骤一般包括以下几个关键步骤：1.准备标记配体：将配体与放射性同位素结合，这通常涉及到将配体与放射性同位素联结的化学反应。
常用的放射性同位素包括^3H（氚）和^125I（碘）等。
此步骤需要进行放射性安全操作。
2.孵育样品：将受体样品与标记配体一起在适当的缓冲液中孵育。
孵育条件（温度、时间等）需根据具体受体和配体的特性进行优化。
3.洗涤步骤：通过洗涤去除未结合的配体。
洗涤步骤可以进行多次，以确保只保留结合复合物。
这一步骤是为了去除非特异性结合而采取的，可以使用高浓度的未标记配体等进行竞争性结合。
4.结合复合物的测定：将洗涤后的样品放入放射性检测设备中，测定放射性信号的强度。
放射性信号的强度与结合复合物的量成正比，可以通过标准曲线或计算公式来计算受体与配体的结合亲和力。
RBA方法具有一些优点和应用前景。
首先，该方法可以在体外定量测定受体与配体之间的结合亲和力。
这对于研究生物体内的受体配体相互作用具有重要意义。
其次，该方法具有高灵敏度，能够测定非常低浓度的受体或配体。
此外，RBA方法还可以用于筛选新药物的受体结合亲和性，以及衡量药物对受体的亲和力的影响。
核医学诊断概述
核医学诊断概述应用开放型放射性核素发射的核射线对疾病进行诊断，在应用原理、方法、设备和防护等方面都独具特点、已形成一门新兴学科，即临床核医学。
核医学虽只有五十多年发展史，但进展迅速、贡献非凡、是医学现代化的主要标志之一。
全国已有650多所医院设有核医学科，目前已开展的诊断项目达15类近百项之多。
诊断方法按放射性核素标记的药物是否引入人体内，分为体内检查法和体外检查法，前者按是否成像又分为显像和非显像两类方法。
放射性核素在诊断上应用的基本原理是示踪原理，现将各类检查法的诊断原理和特点简述如下。
一、体外检查法的诊断原理和特点体外检查法是以放射免疫分析（RIA）为代表的体外放射配体结合分析法。
它是以放射核素标记的配体为示踪剂，以配体（如抗原）和结合剂（如抗体）的结合反应为基础，在试管内完成的微量生物活性物质的检测技术。
这类技术包括放射免疫分析法（RIA）、竞争性蛋白结合分析法（CPBA）、放射受体分析法（RRA），以及放射酶学分析法（REA）等。
以RIA法为例，其原理是：以放射性核素标记的抗原为示踪剂，以非标记抗原（标准抗原或被测抗原）为检测对象，共同与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应。
由于标记抗原与抗体的结合量（因变量）与非标记抗原的含量（自变量）之间，存在竞争性抑制的反函数关系，可依据反映这一函数关系的标准曲线，求出被测抗原的含量。
这类分析技术具有灵敏度高（10-9～10-15g）、特异性强、精密度和准确度高以及应用广泛等特点。
迄今可用本技术测定的体内微量生物活性物质，如激素、蛋白质、抗体、维生素、药物等可达300多种。
对临床各科的疾病诊断和医学基础研究具有重要意义。
Yalow和Berson博士因在1959年创建本法而荣获1977年诺贝尔医学奖。
二、体内检查法的诊断原理和特点引入体内的放射性核素标记药物，与同类非标记药物相似，根据其化学和生物学特性，表现为一定的生物学行为：或被某一脏器的某种细胞摄取、浓聚；或经由某一脏器清除、排出；或参予某一代谢过程，或仅简单地在某一生物区积存等等。
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实
验
AFP放射免疫（快速法）测定
AFP放射免疫（快速法）测定
实验报告
姓名 学号 期、班级 实验名称 实验原理 实验方法（步骤） 实验结果 讨论*
AFP放射免疫（快速法）测定
加样
100 μl 100 125 μI-AFP l 抗体 AFP 缓 冲 液
100μl AFP 10ng/ml
100μl AFP 25ng/ml
单克隆抗体涂被固相载体，形成固相
抗体，通常为试管底部； 试管内加入标准品或待测样品，形成 固相抗原抗体复合物 加入放射性核素标记的单克隆抗体， 形成固相抗体-抗原-*抗体复合物 剩余的标记单克隆抗体则留于液相中， 通过洗管洗去 测量试管中的放射性计数，经标准曲 线就可查出待测物含量
反应式
*Ag+ Ab + Ag *Ag-Ab+ *Ag
限量
Ag-Ab + Ag
Ag: 待测抗原 *Ag: 标记抗原 Ab: 抗体 Ag-Ab: 抗原抗体复合物 *Ag-Ab: 标记抗原抗体复合物
放射免疫分析技术原理示意
标准曲线
基本试剂
标准抗原
标记抗原
即标准品，与 待测物具有相同 的化学结构、免 疫学活性， 是RIA的示综剂， 125I，纯度高，合适的 比活性，标记后抗原 免疫活性不受破坏 特异性高，滴 度高，亲和力大
固相-Ab1+Ag （待测） 固相-Ab1-Ag +*Ab2
固相-Ab1-Ag -*Ab2+*Ab2
基本特点
标记物为抗体，不影响抗原的免疫活性 使用的是单克隆抗体，特异性明显提高 单克隆抗体为大分子物质，碘化标记抗体比
抗原容易，产物比较稳定
检测灵敏度较RIA高，且检测范围扩大 操作更为简便、快速 抗体用量大，成本较高 仅适用于蛋白质类大分子物质的检测
特异性抗体 分离试剂
第二抗体 分离方法 优点：特异性强，分离效果 好，适合自动化。 中性盐和有机溶剂 缺点：二抗用量大，成本高， 硫酸钠，硫酸铵及聚乙二醇（ PEG)等 两次温育，操作时间长 双抗体法 优点：来源容易，价格便宜，分离快 速，不需二次温育。 缺点：结果易受T,PH,试剂浓度等因 素影响。 活性炭 硅酸盐 离子交换树脂 沉淀法 免疫吸附法 优点：简单，快速，经济，材料来源广。 ：专一性差，影响因素多 ：固相材料来源广，价格低，分离 缺点 优点 不用离心，简单，快速。 吸附法 缺点：制备固相试剂费时，费事；抗体 活性的回收率低；大分子抗体与固相连 接时会造成亲和力下降，灵敏度受影响
特异性强 放射性核素不引入体内 应用范围广 被测样品用量小
操作简便
易于自动化
放射免疫分析
RIA
基本原理*
竞争性结合的抑制反应
•非标记抗原（检测对象或标准品） •标记抗原 •抗体限量 •标记和非标记抗原具有相同的免疫活性
•同时与限量的抗体进行免疫结合反应
彼此竞争
相互抑制
反应式*
100μl AFP 50ng/ml
100μl AFP 100ng/ml
100μl AFP 200ng/ml
100μl AFP 400ng/ml
100μl 待测 血清
零标准管
1
2
3
4
5
6
待测管
AFP放射免疫（快速法）测定
温育பைடு நூலகம்
充分摇匀
56°C水浴10min
-20 °C冰箱10min
AFP放射免疫（快速法）测定
固相法
基本操作步骤
加样
温育
分离
放射性测量
绘制标准曲线
查待测物含量
免疫放射分析 IRMA
基本原理
抗原与特异性抗体间的特异性结合 检测对象为抗原 标记的是抗体，抗体过量 标准抗原或待测抗原与抗体的结合 不
存在竞争
非竞争性放射分析
双位点(夹心)固相免疫放射分析法
标准曲线
实验步骤
分离
加分离试剂500μl 充分摇匀室温放置15min 离心 3500转/min，离心15min 弃上清后测沉淀放射性计数
绘制标准曲线
查待测物含量
实验开始
体外放射配体 结合分析
概念-体外放射配体结合分析
*
采用放射性核素标记物为示踪剂， 以特异性结合反应为基础，以放射性测 量为定量手段，在体外对微量活性物质 进行定量检测的一类分析技术
分类
放射性竞争结合分析
放射免疫分析 RIA 放射性非竞争结合分析 免疫放射分析IRMA
体外放射配体结合分析优点
灵敏度高