免疫学实验-凝集试验
免疫学课件——第八章 凝聚性试验
凝聚性试验
一.凝集试验
细菌,红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合 后,在有电解质存在时,抗原颗粒互相凝聚成肉 眼可见的凝集小块,称为凝集反应. 参与反应的抗原称为凝集原,抗体称为凝集 素. 1.直接凝集试验 颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集 现象的试验称作直接凝集试验.
免疫学原理与技术
波片法:定性试验 试管法:定量试验,可以检测血清中是否含有相 应的抗体及抗体的含量,以其两个加号以上 的血清最大稀释度为该血清的凝集价. 生长凝集试验:正在生长繁殖的菌体,由于抗体 的存在,可以凝集生长成团,借助显微镜可 以观测到.
免疫学原理与技术
二.沉淀试验
可溶性抗原(如细菌的内毒素,外毒素,菌体 裂解液病毒的可溶性抗原,血清,组织浸出液等) 与相应的抗体结合,在适量电解质存在下,形成 肉眼可见的白色沉淀,称为沉淀试验.
参加沉淀试验的抗原称为沉淀原,,抗体称为沉淀素,因为沉 淀试验抗原分子小,单位体积含量多,容易过量,所以经常稀释抗原, 并以抗原稀释度作为沉淀试验的效价.
免疫学原理与技术
乳胶凝集试验 致敏乳胶免疫浊度法试验,诊断卡,玻片法 试验. ▲正向间接血凝试验: 用抗原致敏红细胞,以检测血清中抗体. 出现++以上凝集的血清最大稀释倍数既该 血清的血凝价. ▲反向间接血凝试验: 用抗原致敏红细胞以检测抗原称为反向间 接血凝试验.
免疫学原理与技术
▲正向间接血凝抑制试验: 用抗原致敏的红细胞和已知的抗体来检测 未知抗原. ▲反向间接血凝抑制试验: 用抗原致敏的红细胞和已知的抗体来检测 未知抗体.
免疫学原理与技术
单向单扩散
单向双扩散
免疫学原理与技术
双向单扩散
双向双扩散
免疫学原理与技术
临床免疫学：凝集试验
凝胶内沉淀 反应
凝胶免疫电 泳技术
絮状沉淀试验 免疫浊度测定
单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验
对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳
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一、单向免疫扩散试验
原理：将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中， 让待测抗原在凝胶中自由扩散,在两者比例合 适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原 的浓度成正相关。
3
1896年Widal反应诊断伤寒病。 1900年Landsteriner在血凝现象的基础上发现人类
ABO血型系统,并于1930年获得诺贝尔奖。
反应阶段：
• 抗原抗体的特异性结合 • 出现肉眼可见的凝集现象
4
临床应用：定性或半定量检测
根据凝集现象的出现与否定性判断抗原抗体 是否对应。
将血清标本倍比稀释后再进行反应，以出现 凝集反应的最高稀释度作为抗体的滴度（效 价）。
【熟悉】 1、对流免疫电泳、免疫电泳的原理。 2、免疫固定电泳的临床应用和双向免疫扩散的实 际应用。
【了解】单向免疫扩散、对流电泳和免疫电泳的应用。
35
沉淀反应的概念 沉淀反应（precipitation）是指可溶 性抗原与相应抗体在适当条件下发生
特异性结合产生可见沉淀物的现象。
36
沉淀反应
液相沉淀反 应
58
技术要点
先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂 上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷 、分子量等不同将其分开。 为了精确识别单克隆区带，样品同时 在六条泳道上进行测试。 然后将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ 轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道； 参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带 对照，作用一定时间后洗去游离蛋白质 ，染色后观察结果，对样品中所含成分 及其性质进行分析、鉴定。
直接凝集试验实验报告
一、实验目的1. 理解直接凝集试验的原理和应用。
2. 掌握直接凝集试验的操作步骤。
3. 通过实验验证不同抗原与抗体之间的凝集反应。
二、实验原理直接凝集试验是一种免疫学检测方法，主要用于检测血清或血浆中的抗体含量。
其基本原理是：颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）与相应的抗体结合，在适量电解质（通常是0.85%NaCl）存在的条件下出现凝集现象。
直接凝集试验分为玻片凝集试验和试管凝集试验两种，本实验采用玻片凝集试验。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 抗原：细菌、红细胞等3. 抗体：相应的抗体4. 生理盐水5. 玻片6. 移液器7. 显微镜四、实验步骤1. 准备样品：取小鼠血液，分离血清，并按实验设计要求加入相应的抗体。
2. 滴加抗原：在玻片上滴加适量抗原，并用移液器将血清与抗原充分混合。
3. 观察凝集现象：静置一段时间后，用显微镜观察玻片上的凝集现象。
4. 记录结果：根据凝集程度记录实验结果。
五、实验结果1. A组实验：小鼠血清中加入A抗原，观察到的凝集现象为阳性。
2. B组实验：小鼠血清中加入B抗原，观察到的凝集现象为阴性。
3. C组实验：小鼠血清中加入C抗原，观察到的凝集现象为阳性。
六、实验讨论1. 直接凝集试验是一种简单、快速、灵敏的免疫学检测方法，广泛应用于病原微生物、红细胞血型鉴定等领域。
2. 本实验结果表明，小鼠血清中存在针对A抗原和C抗原的抗体，但不存在针对B抗原的抗体。
3. 在进行直接凝集试验时，应注意抗原与抗体的比例、电解质浓度等因素，以确保实验结果的准确性。
七、实验结论1. 直接凝集试验是一种有效的免疫学检测方法，可用于检测血清或血浆中的抗体含量。
2. 本实验成功验证了小鼠血清中存在针对A抗原和C抗原的抗体，但不存在针对B抗原的抗体。
八、实验拓展1. 研究不同抗原与抗体之间的凝集反应动力学。
2. 探讨直接凝集试验在病原微生物检测、血型鉴定等领域的应用前景。
3. 优化直接凝集试验的操作步骤，提高实验结果的准确性和灵敏度。
免疫凝集实验
生物检测作业免疫凝集试验免疫凝集试验颗粒性抗原与相应抗体特异性结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象，成为凝集反应。
直接凝集试验病原菌（如细菌、螺旋体等）颗粒性抗原与相应抗体特异性混合后，在适量电解质存在的条件下，经过一定的反应时间后，出现肉眼可见的凝集现象，称为直接凝集反应。
试验中的抗原称为凝集原；抗体称为凝集素常用的实验方法有玻片法和试管法。
1、玻片法：——细菌薄片凝集试验将已知的抗体滴加于洁净的载玻片或凹玻片孔内，自加入待检病原体悬液混合均匀，同时做生理盐水或正常血清对照。
放置室温内数分钟后即可观察实验结果，出现颗粒状凝集者为阳性反应。
优点：其操作简便、迅速，适用于血型鉴定及微生物的菌种鉴定和分型等。
特别是诊断肠道传染病时用于鉴定病人标本中肠道杆菌的感染。
细菌薄片凝集试验：（1）实验目的：该试验用于菌种的鉴定及分型.（2）实验材料：待测菌培养物、已知菌培养物和已知诊断血清（3）实验过程:1.取洁净玻片一张，用蜡笔画为四格。
2.用接种环无菌去诊断血清各两环分别置于第1、3格中。
3.用接种环取生理盐水各两环分别放于第2、4格中。
4.用接种环取已知菌少许放入第2格生理盐水中混匀，随即转移1环于第1格中混匀。
5.同样用灭菌的接种环取待测菌少许放入第4格生理盐水中混匀，然后移一环菌液于第3格中混匀。
灼烧灭菌。
6.结果：已知菌在诊断血清中应出现颗粒状凝集，若待测菌在诊断血清中也出现颗粒状凝集，表明两种菌为同一种或属。
2、试管法：——肥达试验（试管凝集实验）将已知的抗原与系列等比稀释的待检血清在小试管内混合，39℃温育2~24h后观察结果。
生理盐水加抗原作为对照，应用非特异性自凝现象。
以出现明显的颗粒状或絮片状凝集现象的待检血清最高稀释度作为抗体的效价。
试管凝集实验为半定量试验，常用于某病原微生物感染的免疫学诊断，亦可用已知抗体鉴定未知的抗原。
（1）材料：病人血清、肥达实验诊断抗原、生理盐水、试管、吸管、试管架等。
医学免疫学 免疫凝集实验
4
血细胞状沉 淀，边 缘凝集 呈颗粒 状
67
无凝集， 无凝集， 血细胞 血细胞 沉于管 沉于管 底呈圆 底呈圆 盘状 盘状
实验结果
试管号 1
2
3
4
5
67
现象
凝集强度 ？ ++++ ++++ +++ ++ — —
结果分析
以血清最高稀释度仍能出现“++”凝集 现象者，作为该免疫血清的效价（滴度） 本次实验中，第5管（1：640）呈“++” 凝集，第6管（1：1280）呈“+”凝集， 对照管为“-”，则该血清效价为1： 640
中央呈较小圆盘状沉淀 稍浑浊 ，边缘凝集呈颗粒状
血细胞呈较大的圆盘状 较浑浊 沉淀，边缘有少量凝集 颗粒
无凝集，血细胞沉于管 浑浊 底呈圆盘状
对1号试管是否凝集的判断——改良
试管号 1
2
3
4
5
6
7
现象
凝集强 度 管底血 细胞
上层液 体
++++
血细胞 呈厚膜 状铺于 管底， 边缘略 不平滑
澄清
++++
浑浊
对1号试管是否凝集的判断——改良
• 用新标准算得的血清效价与之前相 同，仍为1：640
影响因素讨论——前后带现象
前后带现象
凝集反应，是 抗原抗体结合 反应中的一种 。在抗原抗体 特异性反应时 ，生成结合物 的量与反应物 的浓度有关， 只有在抗原抗 体分子比例合 适时才出生现 最强的反应
.
影响因素讨论——前后带现象
免疫学实验 凝集反应-ABO血型测定
思考题
• 凝集试验有哪些？可用于检测的原理是什 么？
精棉球等
实验方法与步骤
1、标记玻片：取玻片一张，一分为二， 分别标记为抗A，抗B。
2、采血：用酒精棉球消毒被检者左手无 名指或中指内侧，用采血针刺破皮肤， 用干棉球擦去第一滴血，稍加挤压，使 其流出第二滴血，装入盐水试管，摇匀， 即成血细胞悬液。
3、加抗血清：滴加抗A，抗B血清于玻片 标记处
4、加RBC：在抗A，抗B血清中滴加RBC 各一滴。
实验十一 ABO血型鉴定
目的与要求
• 掌握凝集反应的原理与类型 • 掌握玻片凝集法操作与结果判断 • 熟悉ABO血型鉴定的原理与操作
玻片凝集法-ABO血型鉴定
• 试验目的 通过标准血清抗体鉴定红细胞上ABO血型 系统抗原，掌握盐水介质法进行ABO血型 系统正定型的基本操作方法和结果判断。
实验原理
• 根据IgM类特异性血型抗体与红细胞上特 异性抗原结合能够出现凝集反应的原理， 用已知IgM类特异性标准抗血清与被检红 细胞在盐水介质中反应（室温），若出现 凝集想象，表明被检红细胞膜上有与血型 抗体相对应的抗原，从而判断和鉴定被检 者的血型。
实验材料与方法
• 试剂：抗A血清，抗B血清 • 材料：玻片，采血针，消毒干棉球，酒
5、混匀：前后左右摇动，观察有无血细 胞凝集出现。
6、结果：记录பைடு நூலகம்检者红细胞凝集情况及 血型鉴定结果
ABO血型结果判断
抗B
抗A
血型
-
+
+
-
+
+
-
-
试管凝集试验
• 多用于半定量试验，原则上是用定量抗原 悬液与一系列倍比稀释的受检血清混合， 在保温静置后观察结果，以判定受检血清 中有无相应抗体及其效价。
免疫学实验
免疫学实验整理一、凝集试验、吞噬试验（一）凝集试验1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（二）吞噬试验（示教）1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）名解：1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。
如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。
2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。
3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。
4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。
5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。
6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer.实验及注意点：1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原）检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。
2、直接凝集反应（ABO血型鉴定）：若加A抗体出现凝集说明血清中有A抗原，为A型血。
免疫学实验-凝集试验
实验一凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。
参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。
抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。
根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。
[目的要求]1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。
如被检血清有多份，对照只需做1份。
2. 被检血清稀释：第1管加入2.3ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml弃之，再吸取0.5 ml加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml（见表1-1）。
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实验一凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。
参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。
抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。
根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。
[目的要求]1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。
如被检血清有多份，对照只需做1份。
2. 被检血清稀释：第1管加入2.3ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml弃之，再吸取0.5 ml加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml（见表1-1）。
该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。
3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5ml，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5ml，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml。
4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml。
表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。
6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。
根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。
＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。
＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。
（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。
＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。
＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。
－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。
7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。
牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。
[注意事项]1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。
2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。
阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。
对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。
（二）布氏杆菌病平板凝集试验1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100μL微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80μL、第2格40μL、第3格20μL、第4格10μL。
血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。
每一份检样需换一个tip头。
大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40μL 和20μL ；猪、山羊、绵羊、狗用80μL和40μL。
2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30μL，滴在血清附近，而不与血清接触。
从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。
抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。
3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。
4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。
5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。
＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。
＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。
＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。
＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。
－：液体均匀混浊，无凝集现象。
6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。
表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系平板凝集80μL 40μL 20μL 10μL相当于试管凝集1:25 1:50 1:100 1:2007. 判定标准：同试管凝集试验。
8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。
（三）虎红平板凝集试验这种试验是快速平板凝集试验。
抗原是布氏杆菌加虎红制成。
虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。
1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30μL滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。
在室温（20℃）4-10min内记录反应结果。
同时以阳、阴性血清作对照。
2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。
3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。
（四）鸡白痢平板凝集试验1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30μL）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒充分混合。
2. 结果判定：在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。
[思考题]1. 凝集反应的原理是什么?2. 哪些因素影响细菌凝集试验?3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？实验二病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50μL定量移液器，滴头，微型振荡器。
2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）血球凝集(HA)试验1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：μL）弃504. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。
红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50μL生理盐水。
3. 第１孔加被检鸡血清50μL，吹吸混合均匀，吸50μL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50μL，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 ……；第12孔加新城疫阳性血清50μL，作为血清对照。
4. 自第1孔至12孔各加50μL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50μL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。
表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：μL）6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。
以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。
凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。
附录1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液枸橼酸钠（5H2O） 0.80g枸橼酸（H2O） 0.055g葡萄糖 2.05g氯化钠 0.42g双蒸水加至 100 ml将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。