冰冻蚀刻技术
生物 电子显微镜 6.冷冻制样技术概述
冷冻点：当细胞内液开始凝固时的温度称为冷冻点。 此时为固、液共存状态。
再结晶点：细胞全部被冻结成为固态时的温度。
冷冻点
冰晶增大的过程 细胞损伤的阶段
细胞内开始形成冰晶
再结晶点
全部冻结
细胞浓度越高，冷冻点与再结晶点的温差越小。
植物越冬自我保护
二、冷冻固定方法：
1.冷冻固定的基本流程：
优点：能消除表面张力引起的变形，避免脱水剂对细胞 成分的抽提，较好地保存可溶性物质。
二、冷冻干燥方法：
1.新鲜样品直接冷冻干燥法：
预冷却-80 ℃
鲜样粘 冷
真空
回
在铜片 冻
干燥器 温
固 2.有机溶剂取代定的冷冻干燥法：
常规 包埋
导电 处理
TEM SEM
常规 100% 冷 真空 回
固定 脱水
乙醚
冻 干燥 温
进行
第四节 冷冻断裂复型技术
一、冷冻断裂复型技术及其特点：又叫冷冻蚀刻技术
1.冷冻断裂复型技术： 新鲜样品通过冷冻断裂，将断面制成可以反映样品 形态的复型膜，以便在透射电镜下观察的制样技术。
2.特点： •避免化学处理损伤，能更好地保存细胞生活状态； •能显示细胞劈裂面的超微结构，分辨率高； •图像立体感强； •由铂,碳制成的复型膜，耐受电子束轰击，易于长期保存； •操作简单、样品制备周期短（与超薄切片比较）
考试时间：5月15日（下周三）8：00~10：00 考试地点： 实验时间：
谢谢大家！
再见！
EF面：面向细胞质、核质、线粒体基质的疏水层劈裂面 （E膜的疏水表面）
EF面
外环境
ES面 E膜
PF面
内环境
中医大直属网院2020年7月《细胞生物学》正考-复习资料答案
科目：细胞生物学试卷名称：2020年7月细胞生物学正考满分：100满分100与以下各题总分100相等单选题1.具有细胞分选功能的实验技术是（本题：1分）[A.]电子显微镜技术[B.]层析技术[C.]电泳技术[D.]流式细胞术[E.]细胞融合技术参考解析答案：D2.能够观察肌动蛋白纤维外部形态的是（本题：1分）[A.]荧光显微镜技术[B.]冰冻断裂技术[C.]负染电镜技术[D.]冰冻蚀刻技术[E.]质谱技术参考解析答案：C3.在差速离心中最先沉降的细胞器是（本题：1分）[A.]细胞核[B.]溶酶体[C.]线粒体[D.]过氧化物酶体[E.]核糖体参考解析答案：A4.生物膜的特性是（本题：1分）[A.]流动性和不对称性[B.]不流动性和对称性[C.]流动性和对称性[D.]不流动性和不对称性[E.]不流动性参考解析答案：A5.下列哪一类型的生物膜流动性好（本题：1分）[A.]胆固醇含量高[B.]不饱和脂肪酸含量高[C.]脂肪酸链长[D.]鞘磷脂/卵磷脂比例高[E.]以上都不是参考解析答案：B6.RNA经核孔复合体输出至细胞质是一种（本题：1分）[A.]被动转运[B.]主动转运[C.]易化扩散[D.]简单扩散[E.]共同运输参考解析答案：B7.原核细胞不具备下列哪种结构（本题：1分）[A.]线粒体[B.]核糖体[C.]细胞壁[D.]DNA[E.]细胞膜参考解析答案：A8.内质网腔内能参与蛋白质折叠的是（本题：1分）[A.]过氧化氢酶[B.]葡萄糖-6-磷酸酶[C.]蛋白酶[D.]分子伴侣[E.]磷脂酶参考解析答案：D9.下列具有极性的细胞器是（本题：1分）[A.]高尔基体[B.]核糖体[C.]溶酶体[D.]过氧化物酶体[E.]内质网参考解析答案：A10.加速微管蛋白聚合的药物是（本题：1分）[A.]秋水仙素[B.]紫杉醇[C.]长春花碱[D.]Nocodazole[E.]以上都不是参考解析答案：B11.参与染色体高级结构形成的组蛋白是（本题：1分）[A.]H2A[B.]H2B[C.]H3[D.]H4[E.]H1参考解析答案：E12.在核仁以外区域合成的rRNA是（本题：1分）[A.]45SrRNA[B.]18SrRNA[C.]5.8SrRNA[D.]28SrRNA[E.]5SrRNA参考解析答案：E13.关于Ig-SFCAM结构的错误叙述是（本题：1分）[A.]不依赖于钙离子作用[B.]含有多个免疫球蛋白样结构域[C.]含有二硫键[D.]可介导同亲性及异亲性细胞粘着[E.]以上都正确参考解析答案：E14.胶原的氨基酸序列中，发生羟基化修饰的是（本题：1分）[A.]甘氨酸和赖氨酸[B.]甘氨酸和脯氨酸[C.]脯氨酸和赖氨酸[D.]赖氨酸和丝氨酸[E.]脯氨酸和丝氨酸参考解析答案：C15.有丝分裂与无丝分裂的主要区别在于后者（本题：1分）[A.]不经过染色体的变化，无纺锤体出现[B.]经过染色体的变化，有纺锤体出现[C.]遗传物质不能平均分配[D.]细胞核先分裂，核仁后分裂[E.]细胞核和核仁同时分裂参考解析答案：A16.下列不属于原癌基因的是（本题：1分）[A.]sis[B.]C-myc[C.]ras[D.]cyclinD[E.]myb参考解析答案：D17.细胞的分化方向决定于（本题：1分）[A.]受精卵[B.]8细胞时期[C.]卵裂期[D.]原肠期[E.]中、内、外胚层形成后参考解析答案：D18.细胞老化现象包括（本题：1分）[A.]细胞内环境稳定性降低[B.]DNA复制能力降低[C.]蛋白质合成能力下降[D.]细胞分裂减少甚至停止[E.]以上都正确参考解析答案：E19.细胞凋亡发生的生化改变不包括（本题：1分）[A.]细胞内Ca2+浓度降低[B.]胞浆PH值发生变化[C.]蛋白质合成增加[D.]与切冬酶（caspase）家族有关[E.]DNA发生规则片段化参考解析答案：A20.细胞凋亡时DNA片段大小的规律是（本题：1分）[A.]100bp的整数倍[B.]200bp的整数倍[C.]300bp的整数倍[D.]400bp的整数倍[E.]500bp的整数倍参考解析答案：B名词解释21.冰冻蚀刻电镜技术（分值：3分）参考解析答案：冰冻蚀刻电镜技术：将冰冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，在表面上浮雕出细胞膜的超微结构，对浮雕表面进行铂-碳复型，并除去生物材料，置于载网上作电镜观察。
医学生物学习题集
第一篇概论1.1 细胞生物学概述1.1.1 选择题1.1.1.1 A型题1．利用现代技术和手段从分子、亚细胞和整体水平等不同层次上研究细胞生命活动及其基本规律的科学称BA 细胞遗传学B 细胞生物学C 细胞病理学D 细胞生理学E 细胞形态学2．细胞学说的创始人是BA R．HookB Schleiden and SchwannC R．ＢrownD W．FlemmingE C．Darwin3．最早发现细胞并将其命名为“cell”的学者是AA R．HookB A．LeeuwenhookC R．ＢrownD W．FlemmingE C．Darwin4．最早观察到活细胞的学者是BA R．HookB A．LeeuwenhookC R．ＢrownD W．FlemmingE C．Darwin5．在1858年首先提出“细胞来自细胞”这一著名论断的学者是CA R．HookB A．LeeuwenhookC VirchowD W．FlemmingE C．Darwin6．最早自制显微镜并用于观察细胞的学者是BA Schleiden and SchwannB R．Hook and A．LeeuwenhookC VirchowD R．ＢrownE C．Darwin7．最早发现细胞的遗传物质DNA分子为双螺旋结构的学者是CA Schleiden and SchwannB R．Hook and A．LeeuwenhookC Watson and CrickD R．ＢrownE C．Darwin8．在1933年底设计制造了世界上第一台电子显微镜（投射式）的学者是AA．德国的鲁斯卡(Ruska) B．英国的马丁(Martin) C．比利时的马顿(Marton)D．德国的赫尔穆特(Helmut) E．德国的德里斯特(Driest)9．世界上第一台扫描电镜是由下列哪位科学家研制出来的A．英国的马丁 B．比利时的马顿 C．德国的鲁斯卡 D．德国的克诺尔(Knoll)E．德国的赫尔穆特10．在1944年首次证实 DNA分子为细胞的遗传物质的学者是A．沃森 B．克里克 C．埃弗里(Avery) D．福尔根(Feulgen) E．摩尔根11．在1975年有人将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得能分泌单克隆抗体的杂交瘤，这种单克隆抗体制备技术的发明者是A．柯勒(Kohler) B．奥林斯(Olins) C．罗伯逊(Roberson) D．桑格(Sanger) E．尼伦伯格(Nirenberg)1.1.1.2 X型题12．现代的细胞生物学在哪些层次上来研究细胞的生命活动A．分子水平 B．亚细胞水平 C．细胞整体水平 D．组织水平13．活细胞的基本生命活动有A．生长发育 B．分裂增殖 C．遗传变异 D．衰老与死亡14．19世纪自然科学的三大发现包括A．进化论 B．细胞学说 C．能量守恒定律 D．重演率1.1.2 填空题1．细胞生物学是从、和等3个水平上研究细胞生命活动的科学。
细胞生物学复习资料
第二章细胞生物学实验技术一、名词解释1．显微分辨率（microscopic resolution）---在一定条件下利用显微镜所能看到的精细程度。
2．放射自显影技术（autoradiography）---用于整个细胞时，可以确定放射性标记物在细胞内的定位。
用于凝胶或琼脂平板时，能鉴定出放射性的条带或菌落。
3．双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis）---根据分子质量及等电点的不同将复杂的蛋白质混合物分开。
这种高分辨率的技术能够分离同一混合物中的上千种蛋白质。
4．倒置显微镜（inverted microscope）---一种主要用于观察培养瓶或培养皿中的活细胞生长及分裂状态的特殊显微镜。
与普通光镜相比，其光源、聚光镜和物镜的位置是倒置的，即光源在上，物镜在载物台的下方。
另外，其聚光镜和物镜有较长的工作距离，以方便放置有一定厚度的培养瓶。
二、简答题1．电子显微镜为何不能观察活标本？因为电镜样品的观察室要求高度的真空条件。
2．简述冷冻蚀刻术的原理和方法。
冷冻蚀刻（freeze－etching）技术是在冷冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。
如果将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。
当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂一碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，捞在载网上作电镜观察。
3．比较投射电子显微镜和扫描电子显微镜。
答：都是用于放大与分辨微小结构，都是通过标本电子束的影响来探测标本结构。
TEM：电子束穿过标本，聚焦成像于屏幕或者显像屏上。
用于研究超薄切片标本，有极高的分辨率，可给出细微的胞内结构。
SEM：电子束在标本表面进行扫描，反射的电子聚焦成像于显像屏上。
可以反映未切片标本的的表面特征。
4．扫描隧道显微镜的工作原理及其优越性是什么？扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）由Binnig等1981年发明，是根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。
冰冻蚀刻技术
4、冰冻蚀刻法。
所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。
用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。
冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。
标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中，进行冰冻。
然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。
蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。
然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。
复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。
和投射电子显微镜是靠透过物体的电子成像不同，扫描电子显微镜的成像是靠观察物体表面发射的电子。
扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描。
电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。
二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。
而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。
制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。
1/ 1。
电镜冷冻蚀刻技术
电镜冷冻蚀刻技术嘿，朋友们！今天咱来聊聊电镜冷冻蚀刻技术，这可真是个厉害的玩意儿啊！你想啊，要是咱想看清一个东西细微到极致的样子，那普通的方法可就有点不够看啦。
就好比你想看清楚一只小蚂蚁身上的每一个细节，光靠肉眼那肯定不行呀。
这时候电镜冷冻蚀刻技术就像一把神奇的钥匙，能打开微观世界的大门。
它是怎么做到的呢？简单来说，就是先把样品快速冷冻起来，就像把一个东西瞬间冻在冰里一样。
然后呢，用特殊的方法把它蚀刻一下，这样就能把样品的表面结构清晰地显现出来啦。
这就好像是给微观世界来了一场“大揭秘”！想象一下，那些我们平时根本看不见的微小结构，通过这个技术就能展现在我们眼前，是不是特别神奇？这就好比我们突然有了一双超级厉害的眼睛，能看到别人看不到的东西。
这个技术在好多领域都大显身手呢！比如说在生物学里，科学家们用它来研究细胞的结构，看看细胞里面都有啥秘密。
那感觉就像是在探索一个神秘的微观宇宙，说不定还能发现一些前所未有的东西呢！在材料学领域也很有用呀，可以帮助研究材料的微观特性，让我们能造出更好的材料。
而且哦，这个技术还不断在发展呢！就像我们人类不断进步一样，它也越来越厉害。
以后说不定能让我们看到更加细微、更加神奇的微观世界。
那有人可能会问啦，这个技术难不难啊？其实啊，就和学任何新东西一样，一开始可能会觉得有点难，但只要你认真去学，去钻研，肯定能掌握它的。
就像学骑自行车一样，一开始可能会摔倒，但多练几次不就会了嘛。
电镜冷冻蚀刻技术真的是为我们打开了一扇通往微观奇妙世界的大门，让我们能看到那些隐藏在极小极小世界里的秘密。
它就像是一位无声的探索者，默默地为我们揭示着微观世界的精彩。
我们可真得好好珍惜这个厉害的技术，让它为我们带来更多的惊喜和发现呀！所以啊，可别小瞧了它，它的作用大着呢！。
细胞膜冷冻蚀刻技术
细胞膜冷冻蚀刻技术介绍细胞膜冷冻蚀刻技术是一种先进的高分辨率电子显微镜技术，它通过对细胞膜进行冷冻和蚀刻处理，能够观察细胞膜的微观结构和功能。
本文将对细胞膜冷冻蚀刻技术进行全面、详细、完整且深入地探讨。
背景细胞膜是细胞的重要组成部分，负责维持细胞内外环境的平衡和物质的运输。
细胞膜的结构和功能对于理解细胞活动和疾病发生发展具有重要意义。
传统的电子显微镜技术在观察细胞膜时存在一些局限性，例如样品的固定和处理过程可能会导致伪装或损坏细胞膜的结构。
原理细胞膜冷冻蚀刻技术利用冷冻技术将细胞膜固定在低温下，然后通过蚀刻的方式去除冷冻样品的表面物质。
这种冷冻蚀刻的过程使得细胞膜的结构能够被保留，并且在高分辨率电子显微镜下进行观察。
方法细胞膜冷冻蚀刻技术的方法如下： 1. 样品制备：将细胞样品放置在冷冻固定剂中，使其渗透固定在样品中。
2. 冷冻：将样品迅速冷冻至超低温，通常使用液氮或液氮混合物来冷冻样品。
3. 蚀刻：将冷冻样品放入蚀刻设备中，通过离子束或金属蚀刻剂去除样品的表面物质。
4. 去除蚀刻剂：用适当的方法去除样品中的蚀刻剂，例如洗涤或溶解。
5. 显微镜观察：将样品放入高分辨率电子显微镜中，观察细胞膜的微观结构和功能。
应用细胞膜冷冻蚀刻技术在许多领域中得到了广泛应用： 1. 细胞生物学研究：细胞膜冷冻蚀刻技术可以帮助科学家们观察细胞膜的微观结构和功能，从而揭示细胞内的生物学过程。
2. 药物研发：细胞膜冷冻蚀刻技术可以用于研究药物与细胞膜的相互作用，从而指导药物设计和开发新型药物。
3. 疾病诊断：细胞膜冷冻蚀刻技术可以用于观察病变细胞膜的改变，从而帮助医生们进行疾病诊断和治疗。
优势和挑战细胞膜冷冻蚀刻技术具有以下优势： - 高分辨率：细胞膜冷冻蚀刻技术能够观察到细胞膜的细节结构，具有很高的分辨率。
- 无伪装：由于样品在冷冻过程中没有被固定和处理，细胞膜的结构能够得到真实保留。
- 多样性：细胞膜冷冻蚀刻技术可以应用于不同类型的细胞和样品。
课堂讨论5用X线衍射，核磁共振（NMR）和电镜冷冻蚀刻技术（Cryo-EM）确定
课堂讨论5用X线衍射，核磁共振(NMR)和电镜冷冻蚀刻技术(Cryo-EM)确定大分子结构的方法。
这三种方法都很重要。
评价它们的标准有空间分辨率（能看到什么结构？单个C－C键？或只是蛋白质的总体外形？），时间分辨率（只是一个快照？还是蛋白随时间变化的动态信息？），天然状态的维持（分析可溶性蛋白是在37℃的水浴中吗？或样品需要冷冻或结晶吗？）以及样品的要求（包括纯度，量，复杂程度）。
X-线晶体学―概述：获得极纯的均一样品，并使之结晶。
用X线照射晶体，检测仪记录其衍射图，并用计算机重建分子的原子结构。
―原子分辨能力―能看到单个原子和化学键，最小分辨率可达到~1Å。
这是因为X线波长与化学键长相近（不同于可见光，可见光波长约5000Å），因此其结构可用X 线“看到”。
―没有时间信息：是蛋白质结构的静态快照，没有动态中间物等。
―操作流程：获得极纯的样品。
用常规法使之结晶（通常用悬滴法）；快速将晶体降到接近液氮的温度，以减少热力学振动（增加分辨率）；将晶体固定在一个针上，并置于X-线光路中；用X线照射，用检测仪记录衍射图；旋转晶体，收集更多的衍射图；将同一晶体浸在重金属离子中，并重复上述实验；通过电脑计算，将衍射图转换成二维电子密度图，显示原子的位置（注意：因为H仅有一个电子，因此很难确定H的位置）。
重金属晶体是用于定相，或确定衍射图上形成每一点的波的相位―这对获得电子密度图很重要。
结合多个二维图，得出三维图像；用已知的氨基酸序列及结构合理的相关知识，构建一个符合衍射图像的蛋白模型。
（“模型构建”和“模型精制”过程）R因子：金标准0.59 = 随机（0.35~0.55 = 典型的精制前的初始模型）＞0.25 = 可能是全面的折叠错误＞0.2 = 不错，可能有一些侧链错误＜0.2 = 很好，没有大的问题Rfree = 精制前对数据中的随机子集（5%）计算得出的R；应<0.3且在R因子的10%内。
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4、冰冻蚀刻法。
所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。
用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。
冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。
标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中，进行冰冻。
然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。
蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。
然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。
复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。
和投射电子显微镜是靠透过物体的电子成像不同，扫描电子显微镜的成像是靠观察物体表面发射的电子。
扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描。
电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。
二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。
而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。
制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。