5种提取三七基因组+DNA+方法的比较
几种真菌DNA提取方法的比较
500bp
图 2 提取物 DNA 的扩增产物电泳图
3 讨论 实验发现直接从平板上刮菌丝的方法简单方便，
但是得率偏低，尤其是对于那些菌丝不发达的菌株，而 发酵虽然耗费点时间，但过滤得到的菌体既丰富又易 于研磨，DNA 产量很高。对于沉淀 DNA，异戊醇明显 优于无水乙醇，可以减少 DNA 的损耗。加 PVP(聚乙烯 吡咯烷酮)可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响 。 [9] DNA 提取过程中，最常见的问题是多糖和蛋白的污 染，CTAB 既能裂解细胞，又能有效地沉淀多糖，而适 量加点蛋白酶 K 则可去除蛋白质污染。如果想得到漂 亮的 DNA 条带，可以在检测前向 DNA 中加入适量的 蛋白酶 K，水浴一段时间，再检测，蛋白就会被消灭的 干干净净。CTAB 浓度以 3%为最佳，既能有效除去多 糖等杂质，又易于提纯时与 DNA 分开，不造成额外污 染。SDS 法操作简单、温和，也可提取到高分子量的 DNA，但所得到的产物含糖类杂质较多。
各样品吸取 5 μl 进行电泳，结果显示，三种方法都 可以获得目的 DNA，而且得率都挺高，分子量在 23 kb 左右。CTAB 法提取的 DNA 条带很亮，得率高，但有 降解现象。在提取 DNA 时，已经加入了 RNase 处理， 但是在琼脂糖凝胶的最前端具有明显的亮带，可能是 杂蛋白、DNA 碎片或未消化掉的 RNA。SDS 法提取的 DNA 条带也比较亮，而且也存在杂蛋白，但是完全可 以用于 PCR 扩增。改良的 CTAB 法提取的 DNA 条带 很亮，得率很高，而且凝胶前端的 DNA 碎片或 RNA 带 几乎没有，而且将提取与纯化合二为一，简化了步骤， 但同时也耗费最多。进一步用紫外分光光度计检测经 改良的 CTAB 法所提取的 DNA 质量，其 A /A 260 280比值在 1.80 左右，说明 DNA 纯度很高。
快速提取植物基因组DNA
4 种快速植物基因组DNA 提取方法比较：DNA 是从2 周龄水稻幼苗中提取。
（1）煮沸法：取50 mg 新鲜水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入200 μLTE Buffer，用细玻璃棒捣碎混匀；在沸水上煮10 min，冰浴10 min；于室温下13000 r/min 离心5 min；将上清储存在-20 ℃中。
（2）微波炉法：取50 mg 水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；在700 W 家用微波炉中高热处理5 min，加入100 μL TE Buffer，振荡，13000 r/min离心 5 min；将上清液储存在－20℃。
（3）碱处理法：取50 mg 水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入配好的NaOH 提取液[(Tris-HCL) = 100 mmol/L (pH8.0)，c(NaOH) =300 mmol/L(TritonX-100)=0.3 %]用玻璃棒捣碎混匀，室温静置片刻后13000 r/min 离心3min。
4）TritonX-100 提取法：取50 mg 嫩叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入200 μL 提取缓冲液[c (Tris-HCl) = 20 mmol/L (pH8.0)，c (EDTA) =2mmol/L，c (TritonX-100) = 1.2 %]用细玻璃棒捣碎混匀；65 ℃水浴15 min，13000r/min 离心5 min，将上清储存在－20 ℃。
每个方法做三次重复，分别用上清提取液进行电泳检测。
将提取所得的基因组DNA 用 1.5 %琼脂糖电泳分析，结果表明用试剂盒提取的基因组DNA 最完整，Triton X-100 提取法所得的基因组DNA 条带也较明亮，煮沸法、微波法和碱处理法没有基因组条带。
LAMP检测结果：碱处理法和微波处理法扩增出来的条带亮度低，可能是因为微波和碱破坏了基因组的完整性。
煮沸法和Triton X-100 提取法的检测效果最好，这与提取液的成分能很好的保护基因组的完整性有关，可用于现场LAMP 检测用模板DNA的快速制备。
三七根部总 RNA 不同提取方法的比较
三七根部总 RNA 不同提取方法的比较郑锐东;姚啟聪;廖鹏;吴漫晔【摘要】In order to obtain efficient extraction method and high quality RNA from P .pseudoginseng root,Comparison of Trizol method,CTAB method,modified Trizol method and isolation kit method for total RNA extraction from root of P .pseudoginseng was conducted.Results:The four methods were of various extraction effects,of which,the modified Trizol method with 2.00 OD260/OD280 ,1.90 OD260/OD230 ,1.9 28S∶ 18S,7.4 RIN,386 μg/μL mass concentration was the best.The other three m ethods easily lead to sample degradation or saltion residues.Conclusion:The modified Trizol method is an efficient extraction method of RNA fromP .pseudoginseng root.%为探明三七根部总 RNA 的最佳提取方法，获取高质量RNA，选取三七根部为材料，比较 Tr-izol 试剂法、CTAB 法、改良 Trizol 法和试剂盒法提取三七根部总 RNA 的质量。
结果表明：4种方法提取三七根部 RNA 效果不同，其中以改良 Trizol 法提取 RNA 的质量最高，其 RNA 的 OD260／OD280为2．00， OD260／OD230为1．90，28S∶18S 为1．9，RIN 值为7．4，质量浓度为386μg／μL。
几种提取植物DNA方法的比较
韩玉杰 1 ,贾炜珑 2 ,王自霞 1 ,周小梅 1
(1. 山西大学生命科学与技术学院 ,山西 太原 030006; 2. 天津大学化学系 ,天津 300072)
提取液 (100 mmol/L Tris - HC l, 1. 4 mol/L NaCl, 次抽提 ,离心 ,乙醇沉淀 ,吹干后加 TE溶解 。
20 mmol/L EDTA , 10 mmol/L β - 巯基乙醇 , 2% 1. 3 检测方法
CTAB , pH 8. 0) ,摇匀 , 65℃保温 20 m in,加入等
Com par ison of M ethods in D NA Extraction from Plan ts
HAN Yu2jie1 , J IA W ei2long2 ,W ang Zi2xia1 , ZHOU X iao2m ei1
( 1. S chool of L ife S cience and Technology, S hanxi U n iversity, Ta iyuan 030006, Ch ina; 2. D epa rtm en t of Chem istry, T ian jin U n iversity, T ian jin 300072, Ch ina)
表 1 用于提取 DNA的植物叶片 7种不同处理方式
玉米 (处理编号 )
1 2 3 4 5 6 7
草 (处理编号 )
8 9 10 11 12 13 14
处理方法
鲜样 微波炉内 ,中火 5～8 m in
室温下自然干燥 2周 烘箱内 105℃干燥 20 m in,然后 45℃烘箱干燥 12 h 烘箱内 105℃干燥 20 m in,然后 65℃烘箱干燥 8 h 烘箱内 105℃干燥 20 m in,然后 85℃烘箱干燥 8 h
植物基因组DNA提取技术
EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变
使酚容易去除。
CTAB提取缓冲液的改进配方
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与
问题解析
DNA提取常见问题
问题三：DNA提取量少。 原 因
1.
实验材料不佳或量少
1.
ห้องสมุดไป่ตู้
尽量选用新鲜（幼嫩） 的材料
2.
3. 4.
破壁或裂解不充分
吸附或沉淀不完全 洗涤时DNA丢失
对 策
2.
3.
植物要匀浆研磨充分
增加吸附的时间，或低 温沉淀
4.
小心操作
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
作业
紫外仪上观察电泳带及其位置。 绘制核酸电泳示意图。
思考
1. 结合原理 ，简述 CTAB 法分离 提取植物总DNA的基本过程。 2. 为了获得高质量的植物总 DNA ， 在分离提取过程中应注意那 些问题？
实验一 植物基因组DNA的提取
DNA extraction
农业生物学实验教学中心
DNA是遗传信息的载体，是最重
要的生物信息分子，是分子生物学
研究的主要对象。为了进行测序、
杂交和基因的表达，获得高分子量
和高纯度的DNA是非常重要的前提。
背景知识
DNA的存在形式
与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。 在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋 白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存 在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性 复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和 叶绿体DNA(ctDNA)。
基因组DNA提取方法
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。
B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。
C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。
D.取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。
E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0),-20度保存1小时后, 13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE 溶液中,置4oC保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体,用Washing TE (50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体2次,之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中,先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS,轻轻混匀后50℃放置3h~5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次后,乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中, 70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3 1) 细菌培养:细菌接种于5ml 液体培养基中,37℃摇床(300rpm)培养过液。
2) 细菌收集:取1ml培养物于1.5ml EP 管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH2O 也行)。
3) 菌体裂解:加入6μl50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl, 10%SDS 110μl,20mg/ml 的蛋白酶K 3μl,50℃作用3h或37℃过夜。
几种药用植物DNA提取与纯化方法的比较
6.Worthington —K irsch RL ,Popky G L ,Hutchins FL J r.Uterinearterial embloization for the mangement of leiomy 2omas :quality —of —life assessment and clinical response.Radi 2ology ,1998,208:625—6297.Stancato —Pasik A ,Mitty HA ,Richard HM ,et al.obstetricembolotherapy :effect on menses and pregnancy.Ra 2diology ,1997,204:791—793.8.陈君辉,胡大武,段天红,等.子宫肌瘤介入治疗临床疗效观察.中华放射学杂志,2001,35(5):334—336.9.Ravina J H ,Bouret J M ,Ciraru —Vigneron N ,et al.Re 2course to particular arterial embolization in the treatment of some uterine leiomyoma.Bull Acad Natl Med (French ),1997,181:233—246.(收稿日期2002-05-21)几种药用植物DNA 提取与纯化方法的比较李 军 陕西中医学院生化教研室 (712083)郭晏海 第四军医大学全军基因诊断技术研究所 (710032)党 琳 陕西中医学院生化教研室 (712083)提 要 目的:优化适于中医学院实验室条件下开展药用植物DNA 提取与纯化的实验方法。
方法:①标准操作,②优化简易操作,③wizad TM clean -up system 试剂盒方法。
结果与讨论:优化简易操作省时、经济、易操作。
关键词 DNA 提取;纯化;实验方法中图分类号:R446 R281.4 文献标识码:B DNA 的分离纯化是分子生物学操作中的重要步骤,同样也是药用动植物分子诊断技术中的关键环节。
各种DNA提取方法
各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法一，基因组DNA提取方法制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。
2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。
根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。
试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。
4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。
加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。
加入等体积的异丙醇。
室温10min。
2500rpm离心10min。
弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。
-20℃20min。
9、12000r/min室温离心5min。
弃上清。
将DNA溶于适量TE中。
二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm 离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
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ＰＶＰ 法提取缓冲液：２５０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ，２５ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＥＤＴＡ，
ＤＮＡ 得率（ μｇ ／ｇ） ＝ＤＮＡ 浓度（ μｇ ／ｍＬ） ×提取的 ＤＮＡ
０．５％ ＳＤＳ，２０ ｍｍｏｌ ／Ｌ Ｔｒｉｓ （ｐＨ 值 ８．０）。
体积（ｍＬ） ／材料质量（ｇ） ［１１］ 。
其他试剂：５０ ×ＴＡＥ 缓冲液；２．５ ｍｏｌ ／Ｌ ＫＡｃ，７．５ ｍｏｌ ／Ｌ １．４．３ 琼脂糖凝胶电泳 称取 ０．６ ｇ 琼脂糖于 １００ ｍＬ 锥形
研究工作。 Ｅ －ｍａｉｌ：ｚｈａｏｐｌｕｍｂｌｏｓｓｏｍ７＠１６３．ｃｏｍ。
作为孑遗植物，三七中含有大量的酚类和黄酮类物质 ，因 此提取三七的基因组 ＤＮＡ 具有一定难度，然而在三七的生理 生化、分子生物学研究中均需要提取基因组 ＤＮＡ，因此开展 三七基因组 ＤＮＡ 的提取研究具有重要意义。 目前，尚无三七 基因组 ＤＮＡ 提取方法的研究报道，本试验研究了 ５ 种提取三 七基因组 ＤＮＡ 的方法，以期为三七的科学贮藏及其基因组 ＤＮＡ 的快速、有效提取提供技术支持。
反渗透纯水系统，ＤＹＹ －１２ 型电泳仪，ＳＹＮＧＥＮＥ 凝胶成像分 梳子，凝固成胶（胶厚度不超过 ０．５ ｃｍ），将制好的胶放入电
析系统，电子天平，微波炉，多头磁力加热搅拌器，数显恒温水 泳槽中点样。
浴锅，中科美菱 －８０ ℃冰箱，伊莱克斯 －２０ ℃冰箱。
分Байду номын сангаас取 ６ μＬ ＤＮＡ 样品、４ μＬ ６ ×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ 混匀，在
０．７ ｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ，１０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＥＤＴＡ （ ｐＨ 值 ８．０ ），２０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ２８０ ｎｍ 处测定 ＤＮＡ 的吸光度，计算 ＤＮＡ 浓度：
β－ＭＥ，１％ ＣＴＡＢ。 ＳＤＳ 法提取缓冲液：５００ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ，５００ ｍｍｏｌ ／Ｌ Ｔｒｉｓ
（ｐＨ 值 ８．０ ）， ５０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＥＤＴＡ （ ｐＨ 值 ８ ０ ）， １０ ｍｍｏｌ ／Ｌ β－ＭＥ。
７．５３６ ３ ７．３８６ ５
ＤＮＡ 得率 （ μｇ ／ｇ）
２０．６６６ ３ ２１．７３５ ７
３
ｘ ±ｓ 尿素法 １
０．２１７ ２ ０．２００ ９
０．０８６ ０．３１４
０ ．１５６ ０ ．５９６
０．０９４ ０．３６８
１．８１３ ９ １．８９８ １
１．６５９ ５ １．６１９ ４
７．７８５ ８ ２９．７７９ ７
１．４．２ 浓度、纯度及得率检测 取 ５０ μＬ 原液，加无菌水至 法、ＰＶＰ 法、尿素法、高盐低 ｐＨ 值法，其中最低的 ＤＮＡ 得率
３ ｍＬ 以稀释 ６０ 倍，混匀后用分光光度计在波长 ２３０、２６０、 在 ２０ μｇ ／ｇ 左右。
表 １ 紫外分光光度法检测提取三七基因组 ＤＮＡ 纯度比较
方法
高盐低 ｐＨ 值法
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 试验所用的三七叶均采自云南省砚山县苗乡三七实业有
限公司科技园的苗圃（１０４．３２２ ５°Ｅ，２３．５３０ ２°Ｎ）。 于 ２０１３ 年 ７ 月 １３ 日 １６：３５ 从株高（１０．４７５ ±２．００８）ｃｍ、株间距（５．６７０ ± １．３８２） ｃｍ、种植密度（４２３．２００ ±１５．２９６）ｍ２ 的三七试验地中 按“１ 株 １ 叶”的原则均匀采集一年生的三七叶，小心装入纱 布采样袋中直至装满。 系好标签牌并标注采集的编号、样品 名称和时间，然后小心放入液氮中保存 。
１．４ 试验方法
０．６％琼脂糖凝胶上上样，在 １ ×ＴＡＥ 电泳缓冲液中、８ Ｖ ／ｃｍ
１．４．１ 基因组 ＤＮＡ 的提取 在进行试验前，先将试验用的 电压下电泳 １ ｈ，电泳结束后，在凝胶成像系统上观察并拍照。
研钵、烧杯、玻璃棒、溶液进行高压灭菌。 用高盐低 ｐＨ 值法、 尿素 法、 ＣＴＡＢ 法、 ＳＤＳ 法 和 ＰＶＰ 法 提 取 三 七 叶 基 因 组
ＵＶ －１６０１ 紫外 －可见分光光度计，ＤＨＧ －９０７０Ａ 型电热 约 １ ～２ ｍｉｎ 至琼脂糖全部熔化，液体变透明，取出摇匀即得
恒温鼓风干燥箱，ＴＨＥＲＭＯ 冷冻高速离心机，ＢＩＯ －ＲＡＤ 核酸 ０．６％ 琼脂糖凝胶液。 待胶 冷却 到 ６０ ℃ 左 右， 加入 ５ μＬ
蛋白仪，电热式压力蒸汽灭菌器，ＳＡＮＹＯ 制冰机，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＤＮＡ 染料 Ｇｏｌｄｖｉｅｗ 混匀，倒入 １４ ｃｍ ×６ ｃｍ 的胶板中，插入
重复
叶粉鲜质量 （ ｇ）
１
０．２１８ ８
２
０．２０３ ９
Ｄ２３０ ｎｍ
０．０８２ ０．０７８
Ｄ２６０ ｎｍ
０ ．１５１ ０ ．１４８
Ｄ２８０ ｎｍ
０．０８５ ０．０８９
Ｄ２６０ ｎｍ ／Ｄ２３０ ｎｍ Ｄ２６０ ｎｍ ／Ｄ２８０ ｎｍ
１．８４１ ４ １．８９７ ４
１．７７６ ５ １．６６２ ９
ＤＮＡ 浓度 （ μｇ ／ｍＬ）
植物基因组 ＤＮＡ 的提取方法具有特殊性，提取难易程度 各不相同，主要影响因素有以下几点：（１） 取材种类。 不同植 物 ＤＮＡ 的最佳提 取方法 不同， 如 棉 花 的 最 佳 提 取 方 法 是 ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵） 法［４］ ，茴香的最佳提取方法 是 ＳＤＳ（ 十二烷基磺酸钠）法［５］ 。 （２）取材部位。 已有研究表 明，果树基因组 ＤＮＡ 提取所需的材料可以是嫩叶、成熟叶、幼 嫩果实、韧皮部及形成层 组 织 等［６］ ； 郭 金 英 等 对 桃 基 因 组 ＤＮＡ 的提取方法及部位进行比较研究发现，从嫩叶和幼嫩果 实中提取的 ＤＮＡ 产率较高［７］ ，因此用一般植物的嫩叶可以提 取出较高含量的基因组 ＤＮＡ。 （３）取材时间。 吴少华等在对 木奈基因组 ＤＮＡ 的提取研究中发现，老叶提取的 ＤＮＡ 含量 和质量都不如幼叶［８］ ；沈向等认为，３ 月采集的植物幼叶中提 取的 ＤＮＡ 质量比 ９ 月的高［９］ ；彭建营等提出，取样时间对所 提基因组 ＤＮＡ 的质量无影响［１０］ ，但与产量有关，以旺盛生长 期的幼叶或嫩梢尖最佳［６］ 。
高盐低 ｐＨ 值法提取缓冲液：１００ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＮａＡｃ，５０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸），５００ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ，２．５％ ＰＶＰ（聚乙烯 吡咯烷酮），１０ ｍｍｏｌ ／Ｌ β－ＭＥ（β－巯基乙醇），调节 ｐＨ 值至
５．５。 尿素法提取缓冲液：８ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＣＯ（ＮＨ２ ）２ （脲），０．５ ｍｏｌ ／Ｌ
收稿日期：２０１３ －０９ －１６ 基金项目：国家自然科学基金（ 编号：３１０６００４５、３１２６００９１） 。 作 者 简 介 ：白雪嵩（ １９８９ — ） ，女 ，黑龙江鸡西 人，硕 士 研 究 生，从 事 植 物
生理生化和分子生物学研究。 Ｅ －ｍａｉｌ：ｂａｏｂｅｉｙｉｙｉ１２２５＠１２６．ｃｏｍ。 通信作者：赵昶灵，男，博 士，教 授，从 事 植 物 生 理 生 化 和 分 子 生 物 学
ＮａＣｌ， ５０ ｍｍｏｌ ／Ｌ Ｔｒｉｓ （ ｐＨ 值 ８．０ ）， ２０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＥＤＴＡ， １０ ｍｍｏｌ ／Ｌ β－ＭＥ，２％ ＰＶＰ。
ＣＴＡＢ 法 提 取 缓 冲 液： ５０ ｍｍｏｌ ／ＬＴｒｉｓ （ ｐＨ 值 ８．０ ），
江苏农业科学 ２０１４ 年第 ４２ 卷第 ５ 期
—５５ —
三七（ Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）别称田七、金不换，为五加科人 参属植物，枟本草纲目拾遗枠 中记载：“ 人参补气第一，三七补 血第一，味同而功亦等 ，故称人参三七，为中药之最珍贵者” ， 可见三七是一种重要而名贵的药材［１］ ，扬名中外的中成药 “云南白药”和“片仔癀” 即以三七为主要原料制成。 三七味 甘、微苦，性温，归肝、 肾经， 具 有 止 血、 散 瘀、 消 肿、 止 痛 等 功 效。 三七的分布范围狭窄，仅分布于 ２３°３０′Ｎ 附近的中、高海 拔地区［２］ ，中国的三七主产于云南西南的山区，云南省文山 州现在被定为三七的原产地和主产地。 三七的栽培条件甚为 苛刻，性喜温凉，一般多栽培于年相对湿度较大的半山区缓坡 地上，忌阳光直射，需透光率为 １５％的人工阴棚才可正常生 长，宜在海拔为 １ ５００ ｍ 左右的地区种植［３］ 。
２１．５０７ ７ ２１．３０３ ２ ±０．４５９ ９
８８．９３８ ９
２
０．２１５ ３
０．２３３
０ ．３９３
０．２３５
１．６８６ ７
１．６７２ ５
１９．６２７ ２
５４．６９７ ３
３
ｘ ±ｓ ＣＴＡＢ 法 １
０．２２０ ２ ０．２１６ ５
０．１７７ ０．４６６
０ ．３２５ ０ ．８２９
０．１８３ ０．４８４
将液氮中保存的三七叶样品于实验室中进行后续处理。 以“ 后放入先取出” 的顺序取出纱布采样袋，先将采样袋拉至 液氮罐口，等采样袋不再往下滴落大量液氮时迅速转移至试 验台上，在台上垫上 １ 层厚纸板，用硬物将袋中的三七幼叶迅 速趁脆打碎至粉状，然后将采样袋中的碎样转移入 ５０ ｍＬ 离 心管中，标记好样品名称和时间，置于 －８０ ℃超低温冰箱保 存备用。 重复上述步骤，处理全部样品。 试验时所需的叶片 再用液氮进行更细致的研磨 。 １．２ 试验试剂
ＮＨ４ Ａｃ， １０％ ＳＤＳ， ＣＨＣｌ３ ∶Ｃ５ Ｈ１２ Ｏ（２４ ∶１ ）， 无 水 Ｃ２ Ｈ５ ＯＨ， （ＣＨ３ ）２ ＣＨＯＨ，７０％ Ｃ２ Ｈ５ ＯＨ，无菌水。 １．３ 试验仪器
瓶中，加入 １００ ｍＬ １ ×ＴＡＥ 稀释缓冲液，用保鲜膜封口以避免 水蒸气过度散失，在保鲜膜上用枪头扎个小孔 ，使得加热过程 中可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大；放入微波炉里加热
２ 结果与分析
ＤＮＡ［５］ ：取 ０．２ ｇ 样品，加入液氮并将样品研磨成粉末，再加 ２．１ 浓度、纯度及得率
入 ９００ μＬ 相 应 的 提 取 缓 冲 液； 抽 提 用 ＣＨＣｌ３ ∶Ｃ５ Ｈ１２ Ｏ （２４ ∶１）；省去了 ＲＮａｓｅ。