用于PCR分析的芥菜型油菜总DNA的快速提取

９ ￣ 预 变 性 ３ ｉ ；３Ｃ变 性 ５ ｓ５ ￣ 退 火 ５ ｓ７ ￣ 延 长 ４（ ２ ｍ ｎ９￣ ０ ；７（ ２ ０ ：２（ ２ １０． 环 ３ ０ ｓ循 ９次 ，２Ｃ 长 ５ ｎ ７ｑ延 ｍｉ。
ＤＮＡ 的快速 提取 是 分子标 记 技 术广 泛 应用 的基 础 。 一
清 液 １０ Ｌ， 入 ２倍体 积 冰 冷 无水 乙醇 ， 匀 ． ２ ￣ 冰 ５Ｄ 加 混 置一 ０（ ２
般 植物 ＤＮＡ提 取技 术大 都 采 用 ＣＴ Ｂ法 、ＤＳ法 。 研 究 Ａ Ｓ 本
在 前人 的基础 上改 进了 ＤＮＡ 的提取 方法 ． 并根据 油 菜叶 子 蛋 白多 、 脂类 物质 含量 高 、 ＤＮＡ难 以 提取 的特 点 ． 选择 了成 苗 时期 叶 片为 材 料 ， 索可 用于 Ｐ 摸 ＣＲ 分 析 的 ＤＮＡ快 速 提 取 方法 ， 并优 化 了芥 菜型 油菜 Ｐ Ｒ 反应体 系 。 Ｃ
（５ ） ｇ幼 嫩叶 片 ， 液 氮 ， 磨成 粉 末 状 。 ． 加 研 迅速 加 入 ２ ｍＬ上述
ＮＣＣＩ 由上 海 生物 工程 技 术 服 务有 限公 司 合成 。 ２ １ ； 反应 体 系
和扩 增程 序 参照 《 向新基 因 分子 克隆 策策 略 》 方法 进 行 靶 的
优 化 纠 反 应 体 系 总 体 积 为 ２ １ ， 应 体 系 各 成 分 见 表 １ 。 ５ Ｌ反 ＊ 。
１ 材 料 与 方 法
箱 ２ ｍｉ 。 １ ０ ｒｍ 离心 ３ ｎ 倒 去 上清 液 ， ７ ％乙醇 ０ ｎ ⑩ ００ ０ｐ ｍｉ ， 用 ０
洗 涤 ２ ３ 。 瞬时 离心 ， ２ Ｄ － 次 ⑩ 用 ０ Ｌ吸 取 残留 液体 ， 置于超 净
工 作 台 上 吹 干 。 用 灭 菌 超 纯水 或 Ｔ １ｍｍｏ／ ｉ Ｃ ： ⑥ Ｅ（０ ｌＬＴｒ— Ｉ ｓ ０ ｍｍｏ／ ＤＴ １ ０ Ｌ溶解ＤＮＡ。 用核 酸 蛋 白质 分 析仪 ． １ ｌＬＥ Ａ）０ １ ｘ ⑧
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大 田农艺
现 代农 业科技 ｝ ０ ８年 第 １ ２０ ６期
用 于 Ｐ Ｒ 分析 的芥 菜型 油 菜 总 ＤＮ 的快 速提 取 Ｃ Ａ
严 明理 刘忠松 官春 云 刘丽莉
（湖 南 科 技 大 学 生命 科 学院 ， 南 湘 潭 ４１２ １ 湖 南 农 业 大 学作 物 基 因 工程 重 点 实 验 室 ） 湖 １０ ； 摘 要 通 过 对 所 提 ＤＮＡ 质 量 、 率 和 Ｐ 效 ＣＲ 检 测 ， 立 和 优 化 了 可 用 于 Ｐ 建 ＣＲ 分 析 的 芥 莱 型 油 菜 总 ＤＮＡ 的 提 取 方 法 ． 一 方 法 快 速 ． 这 所 提 的 ＤＮＡ 质 量 好 ， 在 芥 菜 型 油 菜 生 长 发 育 早 期 进 行 。 可 关 键 词 芥 菜 型 油 菜 ： 速 提 取 ＤＮＡ； Ｃ 分 析 快 ＰＲ 中 图 分 类 号 Ｑ５ ３；５ ５４ １ ２ ￥ ６ ．０ 文献 标识 码 Ａ 文 章编 号 １ ０ — ７ ９ ２ ０ ）６ １ ２ （ ０ ７ ５ ３ （０ ８ １ —０ ７ 一） ２
紫叶芥 加 适量 的活性 炭 ， 吸附 色 素 ）④ 加 入等 体积 的氯 仿一 。
异 戊 醇 混 合 液 （ 仿 ： 戊 醇 ＝ ４ １ 充 分 摇 匀 ，３Ｃ水 浴 氯 异 ２ ：） ６￣
２ ｍｉ。⑤ 取 出 离 心 管 迅 速 置 于 － ０（冰 箱 冷 却 ３ ５ ｎ ５ ｎ ２￣ ２ ￣ ｍｉ ， １ ０ ｒｍ 离心 ５ ｎ ⑥ 小 心 取 出 离心 管 ． 剪 口的 ０２ ２Ｏ ０ｐ ｍｉ。 用 ． ｍＬ 吸 头吸 取 上清 液 ３ ０ Ｌ 合 并 ２管 上清 液 。 加 入等 体 积 的 ０１ ， ｘ ⑦ 氯仿 一 戊 醇 ， 分 混匀 ，２Ｏ ０ｐ 离 心 ４ ｎ ⑧ 用剪 口的 异 充 １ ０ ｒｍ ｍｉ。
０２ ．ｍＬ吸 头吸 取 上清 液 ４ ０ Ｌ转 入 １５ ０Ｄ ． ｍＬ离 心管 中 ． 入 加 ３ ｌ Ａ ｍｏ／ Ｎａ Ｃ使 其终 浓度至 ０ Ｍ（ １ ０ Ｌ上 清液 加 １ １ Ｌ 每 ０￣ ３ １１ 引物 １反应 扩 增 程 序 为 （ ｇａ ｉ ｔ ＣＲ 热 循 环 仪 ） Ｔ－ ｒｄｅ ｎＰ ： ９ ￣ 预 变 性 ３ ｉ ；３Ｃ变 性 ５ ｓ５ ￣ ４（ ２ ｍ ｎ９ ￣ ０ ；５Ｃ退 火 ５ ｓ７ ￣ 延 长 ０ ：２（ ２ １ ０， ０ ｓ 循环 ３ ９次 ，２（延 长 ５ ｎ 引 物 ２反应 扩 增 程 亭 为 ： ７￣ ２ ｍｉ。
检 测 浓度 ， 结 合 琼 脂 糖凝 胶 电泳 检 测质 量 ， 置 于－ ０（ 并 后 ７￣ ２
冰 箱长 期保存 。
１１ 试 验 材 料 ．
１２２ 特 异引 物 Ｐ Ｒ。 ．． Ｃ 引物 １的上 游引 物为 Ｇ ＡＧＡ ＡＧ ＴＣ Ａ
ＡＧ ＡＣＣ ＧＴＮＴ ＧＹＧＴ ＮＡＣ、 游 引 物 为 ＴＴ 下 ＣＣＡ ＴＣ ＴＧ Ｔ ＡＣ Ｔ ＣＧＧＹＴ ＤＡ 引 物 ２的 上 游 引 物 为 Ｃ ＣＴ ＧＣＴ Ｔ Ｔ Ｔ； ＡＴ ＴＧ Ａ ＴＧＧ ＣＮＧ 、 游 引 物 为 ＣＴ ＡＣＧ ＡＧＧ ＮＡ Ｃ 下 ＴＧ ＧＡ ＡＣＧ Ｒ ＮＡ
表 １ 反 应 体 系
Байду номын сангаас
提取液 ， 轻轻 摇 动 研钵 ， 材 料在 提 取 液 中 分散 均 匀 。 静 使 ③
置 １ｍｉ 用剪 口的 ｌ ０ ｎ， ｍＬ吸 头 吸 取 ６ ０ Ｌ上清 液 匀速 加 入 ０Ｄ
已 编 号 的 １５ 灭 菌 ｅｐ ｎ ｏｆ 中 ， 材 料 取 ２管 （ 中 ． ｍＬ ｐｅｄｒ管 每 其
芥 菜型地 方 品种为 四川 黄籽和 紫叶 芥 的 自交系 。
１ ． 方 法 ２
提取 液配方采 用文献法 Ⅲ 分别配 Ｓ ， ＤＳ和 ＣＴ Ｂ 取液 。 Ａ 提
１ ． 油菜 总 ＤＮＡ提 取步 骤 。 在 新配 ＤＮＡ提 取液 中加 ．１ ２ ① Ｂ 一巯基 乙醇 ， 毫 升提 取 液加 ４ ＬＢ 每 Ｄ 一巯 基 乙醇 备 用 。 取 ②