第4章 载体的选择与构建
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建目的基因克隆引物设计pcr质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液pcr上述菌液pcr有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。
一、原理依赖于限制性核酸内切酶，dna连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取两个装有液体培养基的3ml试管（视情况而定），向每根试管中加入40-100μL菌株，摇匀过夜。
2、提质粒（也就是载体）按照质量增强颗粒试剂盒中的说明操作（根据情况在洗脱的最后一步再清洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂量（单位：UL）质粒所需内切酶10反应缓冲液2限制性内切酶1h2o7所需将加好的ep管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4.电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收凝胶：使用琼脂糖和缓冲液逐个制备凝胶。
切割凝胶后，回收目标产物，并具有纯化目标产物的功能；试验凝胶：琼脂糖和缓冲液按1:2的比例制备。
以测试目标波段是否与预期一致。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的dna溶液纯化；产物纯化是将较纯的dna溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5.载体与靶基因的连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
引物设计和载体构建知识点
引物设计和载体构建知识点引物设计和载体构建是分子生物学中重要且基础的实验技术，它们在基因克隆、基因组编辑等方面起到了不可替代的作用。
本文将对引物设计和载体构建的相关知识点进行介绍。
一、引物设计引物是指在PCR等实验中用于扩增特定DNA片段的短寡核苷酸序列。
一个好的引物设计能够确保PCR扩增的特异性和高效性。
1. 引物长度引物的长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增非特异性产物，而过长的引物则可能降低扩增效率。
2. 引物序列引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，并且避免二聚体和头部稳定性等问题。
同时，还要注意避免引物内部和引物之间的序列相互互补。
3. 引物的Tm值引物的Tm值是指引物与目标DNA片段结合的解离温度。
引物的Tm值应该在50-65摄氏度之间，以确保引物的特异性和高效性。
4. 引物的GC含量引物的GC含量直接影响引物的稳定性和特异性。
过高或过低的GC含量可能导致非特异性扩增产物的生成。
通常情况下，GC含量在40-60%之间较为理想。
二、载体构建载体是指在基因工程中用于携带外源DNA片段并将其导入到宿主细胞中的分子。
载体构建是基因克隆和基因组编辑等实验的基础。
1. 选择合适的载体选择合适的载体是载体构建的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和噬菌体等。
根据实验需要选择合适的载体，例如质粒常用于DNA片段的克隆和表达，而病毒则常用于基因传递和基因治疗。
2. 载体的线性化和限制酶切线性化载体有助于DNA片段的插入和连接。
通过使用适当的限制酶对载体进行切割，生成具有完整黏性末端的线性载体。
3. DNA片段的连接将目标DNA片段与线性载体进行连接，一般采用DNA连接酶或者DNA ligation kit。
连接后的载体能够稳定地携带外源DNA片段。
4. 载体的转化和筛选将构建好的载体导入到宿主细胞中，通过培养基中的选择性抗生素或者其他筛选方法选择具有外源DNA片段的转化子。
总结：引物设计和载体构建是分子生物学实验中的重要环节，它们对于基因克隆、基因组编辑等研究具有重要意义。
载体构建注意事项
载体构建注意事项在进行载体构建时，我们需要注意一些重要的事项，以确保构建的效果和质量。
本文将就这些注意事项进行详细介绍，希望能对大家有所帮助。
一、选择合适的载体材料在进行载体构建时，首先需要选择合适的载体材料。
载体材料应具备以下特点：具有良好的生物相容性，能够与生物体组织良好地结合；具有适当的力学性能，能够承受所需的载荷；具有良好的可加工性，便于进行构建和加工等。
常用的载体材料包括生物陶瓷、生物高分子材料、金属材料等。
二、考虑载体的结构设计在进行载体构建时，其结构设计也是非常重要的。
合理的结构设计可以提高载体的稳定性和功能性。
在设计载体的结构时，应充分考虑载体的应用场景和所需功能，并结合材料的特性进行合理设计。
例如，如果需要构建一个用于骨组织工程的载体，可以设计成多孔结构，以增加载体与细胞的接触面积和生物活性。
三、注意载体的表面处理载体的表面处理对于载体的性能和功能起着重要的影响。
通过合适的表面处理可以改善载体的生物相容性、生物活性和降解性能等。
常用的载体表面处理方法包括化学处理、物理处理和生物处理等。
例如，可以通过表面改性、离子注入等方法改变载体表面的化学性质；通过等离子体处理、激光处理等方法改变载体表面的形貌和结构。
四、选择适当的载体构建技术载体构建技术是实现载体构建的关键。
目前常用的载体构建技术包括三维打印、溶胶-凝胶法、纺丝法、电化学沉积法等。
在选择载体构建技术时，应根据载体的形态和所需功能选择合适的技术。
同时，还应考虑技术的成本、工艺复杂度、构建速度等因素。
五、进行载体的性能测试与评估在完成载体的构建后，还需要对其进行性能测试与评估，以确保其满足设计要求。
常用的性能测试包括载体的力学性能测试、生物相容性测试、生物活性测试等。
通过这些测试可以评估载体的稳定性、生物相容性和功能性等指标。
六、注意载体的保存与运输在完成载体构建后，应注意其保存与运输。
一般来说，载体应存放在干燥、阴凉和无菌的环境中，以防止载体的污染和降解。
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤
1. 选择载体，首先需要选择合适的载体，常用的载体包括质粒、病毒、人工染色体等。
选择载体时需要考虑载体大小、复制方式、
宿主范围等因素。
2. 线性化载体，将所选载体进行线性化处理，通常采用限制性
内切酶对载体进行切割，生成线性化的载体。
3. 外源基因插入，将待插入的外源基因与线性化载体进行连接。
这一步通常需要利用DNA连接酶或者DNA重组酶来实现。
4. 载体转化，将重组后的载体导入到宿主细胞中。
这一步通常
采用转化、转染或者电穿孔等方法。
5. 筛选正常重组子代，经过载体转化后，需要进行筛选以获得
正常重组的子代细胞。
通常采用抗生素筛选或者标记基因筛选的方式。
6. 鉴定重组子代，对筛选得到的细胞进行PCR、酶切、测序等
方法进行鉴定，确保重组载体的构建成功。
总的来说，重组载体构建的方法和步骤包括选择载体、线性化载体、外源基因插入、载体转化、筛选正常重组子代和鉴定重组子代。
这些步骤需要严格操作，并且需要根据具体实验情况进行调整和优化。
希望这些信息能够对你有所帮助。
基因治疗的实验流程与操作步骤
基因治疗的实验流程与操作步骤基因治疗是一种通过在人体内引入、修复或替代缺陷基因来治疗遗传性疾病的方法。
这一领域的研究和开发已经取得了许多重要的突破，为许多患者提供了新的治疗方案。
在进行基因治疗时，研究人员需要按照一系列特定的实验流程和操作步骤进行操作。
本文将详细介绍基因治疗的实验流程和相关操作步骤。
1. 遗传疾病的诊断与基因定位在进行基因治疗之前，首先需要进行遗传疾病的诊断。
通过对患者的病史、家族病史和临床表现进行分析，确定患者是否患有遗传性疾病。
如果确认患者患有遗传性疾病，接下来需要进行基因定位，即确定导致疾病的具体基因突变位置。
2. 基因治疗的载体选择与构建基因治疗通常需要使用载体来将治疗基因输送到患者的细胞中。
常用的载体包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体通常具有高度传染性和较高的基因转导效率，而非病毒载体相对较安全。
研究人员需要选择合适的载体并进行构建，将治疗基因插入载体中。
3. 基因治疗载体的扩增与提纯构建好的基因治疗载体需要进行扩增以获取足够的量。
通常使用细菌或哺乳动物细胞进行大规模扩增。
扩增后，载体需要经过提纯过程去除杂质，得到纯净的载体。
4. 细胞培养与基因治疗载体转染在进行基因治疗之前，需要进行细胞培养以获取足够的目标细胞。
根据不同的研究需求，可以选择不同类型的细胞进行培养。
常用的细胞包括体外培养的细胞系和患者体内采集到的细胞。
细胞培养完成后，需要将基因治疗载体转染到目标细胞中。
5. 基因治疗载体在细胞中的表达与功能验证转染完成后，需要验证基因治疗载体在细胞中的表达情况以及是否具有治疗效果。
可以通过检测携带治疗基因的载体在细胞内的表达水平，以及观察是否能够修复目标基因的功能缺陷。
这些验证实验可以在细胞层面和动物模型上进行。
6. 动物模型的建立与基因治疗效果评估基因治疗的效果通常需要在动物模型上进行评估。
研究人员可以选择合适的动物模型，如小鼠、大鼠或猪等。
构建好的载体可以通过注射或其他途径直接引入动物体内。
第四章-催化剂载体及助剂
载体的概念
载体是活性组分及助剂的骨架，通 常为具有足够机械强度的多孔性物 质
载体的类型
依据来源分类 天然物质 人工合成
载体的类型
依据比表面大小
低比表面积载体：比表面积<20m2/g（无孔低 比表面载体，如石英粉、SiC及钢铝石，比表 面积<1m2/g以下，硬度高、导热性好、耐热性 好，常用于热效应较大的氧化反应；有孔低比 表面载体，如浮石、SiC粉末烧结体、耐火砖、 硅藻土及烧结金属等，特点是在高温下有稳定 的结构，具有较高的硬度和导热系数）
副反应的发生，例如对于高熔点、低表面的载 体。但对于一些特殊的反应过程，可以利用载 体的表面性质（如酸碱性）提供适宜的活性中 心，以改善催化剂的反应性能。
载体的作用
提供活性中心 例如，双功能铂重整催化剂Pt/γ-Al2O3，金属 承担加氢和脱氢的功能；酸性γ -Al2O3载体承 担裂解、异构和环化等功能。
二氧化钛 具有锐钛矿、板钛矿和金红石三种结晶状态 板钛矿不稳定难以合成；锐钛矿在较低温度下
生成，比表面较大；锐钛矿在600～1000oC加 热变为金红石，比表面急剧下降
常用载体简介
二氧化钛 TiO2表面具有酸性，以L酸中心为主，不
同的制备方法可以调变其酸性 如含1-10%其他金属氧化物可显酸性，
载体的作用
提高催化剂抗中毒性能 催化剂使用过程中常会因各种原因而失
活，尤其是一些金属催化剂，如在反应 物中含有可以与活性组分发生结合反应 形成稳定的化合物时活性会明显下降， 即催化剂中毒
载体的作用
提高催化剂抗中毒性能 例如，烃类蒸汽转化催化剂的活性组分Ni与S
或Cl接触时会形成稳定的硫化物或氯化物，若 将金属活性组分负载于载体上，可以提高催 化剂的抗中毒能力，不仅由于载体使活性表 面增加，降低对毒物的敏感性，而且载体还 有分解和吸附毒物的作用。
选择合适的表达载体构建酵母菌表面展示系统
选择合适的表达载体构建酵母菌表面展示系统酵母菌表面展示系统是一种重要的生物技术工具，它能够使酵母菌表面展示不同的蛋白质、多肽或者抗原，以达到特定的研究目的。
选择合适的表达载体对于构建有效的酵母菌表面展示系统至关重要。
在本回答中，我将介绍选择合适的表达载体的关键因素，并讨论几种常用的表达载体和它们的优缺点。
选择合适的表达载体应考虑以下几个因素：表达载体的来源和类型、可调控性、克隆容量和稳定性。
首先，根据研究需求，可以选择天然酵母表达载体如pYr和pYX，或可自行构建的表达载体如pPICZ。
其次，要考虑表达载体的可调控性，即是否能够实现基因表达的调控，例如通过响应外源诱导剂或温度来控制基因的表达。
此外，克隆容量是个重要因素，因为较大的载体通常能够携带较大的外源基因。
最后，稳定性是指表达载体在酵母细胞中是否容易产生丢失或不稳定，因此选择一个稳定的表达载体可以确保长期高效的基因表达。
在构建酵母菌表面展示系统中，以下是几种常用的表达载体及其优缺点：1. pYr表达载体：pYr是一种基于天然酵母表达载体，能够高效地在酵母菌表面展示外源蛋白。
它具有较高的表达水平和稳定性，并且可以通过改变培养条件控制基因的表达。
另外，pYr载体的克隆容量较大，可以携带较大的外源基因。
然而，pYr载体的缺点是可能存在背景表达和在酵母菌群体中存在多拷贝插入，这可能会导致表达系统的不稳定性。
2. pYX表达载体：pYX是另一种基于天然酵母表达载体，它可以实现高效的酵母菌表面展示。
与pYr相比，pYX载体的优点在于其表达水平更高、表达系统更稳定，并且不易发生多拷贝插入。
此外，pYX载体的克隆容量较大，可以携带较大的外源基因。
然而，pYX载体的缺点是其表达水平很高，可能会导致细胞毒性和表达产物的不稳定性。
3. pPICZ表达载体：pPICZ是一种自行构建的表达载体，通常用于构建酵母菌表面展示系统。
它具有较高的表达水平和表达稳定性，并且能够在酵母细胞中实现可调控的外源基因表达。
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大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
质粒一般只带有少量复制需要的基因，其它由宿主提供。 广宿主质粒一般携带复制所需的所有或大部分基因，而且启动子、 RBS位点都可以被多种宿主识别。 质粒中除了复制子之外的序列都不是必须序列，可以用其它序列 替换来进行基因克隆或表达。
第四章 载体的选择与构建
主要内容
1.细菌质粒载体 2.噬菌体载体 3.酵母细胞载体及大容量载体 4.动、植物载体
★基因工程载体：
携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具。
★载体的一般特性：
在宿主中能自我复制或借助宿主染色体进行复制 容易从宿主细胞中分离纯化 具有容纳外源DNA分子的能力
colE1 replicon
1.3.2 拷贝数控制机理 反义RNA对拷贝数的调控 RNAII被RNaseH切割后充 当复制引物链（前导链的 引物），而RNAI与其结合 后阻止RNaseH的切割 质粒编码的Rop蛋白二聚 体可提高两种RNA结合复 合物的稳定性 质粒拷贝数越高， Rop、 RNAI浓度越大，最终终止 复制 细胞分裂后，Rop及RNAI 浓度变小，开始进行复制
RepA 调控
Iterons are directly repeated sequences（17～22bp) which play an important role in regulation of plasmid copy number in bacterial cells （重复子） Ori附近的repA基因编码RepA蛋 白，其对自身的表达具有负调节 作用 RepA蛋白可以和Iterons结合，促 进复制复合物的形成，从而开始 质粒的复制 质粒拷贝数高时， RepA蛋白浓 度高，形成二聚体，两个质粒聚 集连在一起，复制停止。细胞分 裂后重新复制
oriT位点：oriT位点不仅是质粒转移的起始位点，也是质粒转移后DNA 末端再环化的位点，因此质粒必须具有oriT位点才能进行自主转移。
自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的oriT位点的非自主转移质 粒进行转移，如将自主转移质粒整合到染色体上后，带动染色体转移也 是从质粒的oriT位点开始的。
（2）滚环复制
在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制，如pC194, pE194 等，这种方式会造成质粒结构的不稳定，存在大量的单链质粒DNA
1.7 质粒的转移性
质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞 ，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移。
质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能 进行，即接合作用 (conjugation)，这类质粒被称为自主转移质 粒(self-transmissible plasmid)或接合质粒(conjugative plasmid) 。 有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒 所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmid) ，可以借助这种方式将重组质粒导入难于转化的宿主中。
一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的 复制有时和它们的宿主细胞有关，例如某些质粒在大肠杆菌内的复制属 严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
1.2.2 按照构型： 环形双链DNA分子
共价闭合环状：两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型 开环DNA：一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口 线状DNA：这种质粒的双链断裂，由环状变为呈线状
不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子
细菌种类
质粒不相容群 IncFⅠ IncFⅡ IncFⅢ IncFⅣ IncA IncC IncH IncI IncM IncN IncO IncP IncQ IncW IncX pT181 pUB110 pSN2
代表性质粒 F, R386, R455, ColV R1, R100 Col1B-K98 R124 RA1 R40a, R55 R27, R726
有的质粒具有宿主致死功能，杀死丢失质粒的细胞，如F质粒的ccdA(编码解 毒剂）,ccdB（编码毒性蛋白）
1.5 质粒的不相容性 ★
用同一复制系统的两种质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼 此竟争，这样的质粒在同一个细胞中不能和平共处。这种现象称之为不相 容性
若两种质粒拷贝数 不一样，分配有利 于高拷贝数质粒
1.2.3 按照接合能力: 接合型质粒（F质粒） 非接合型质粒
1.2.4 按照宿主范围: 广宿主质粒（以及穿梭质粒） 单一宿主质粒 1.2.5 按照宿主中的存在形式: 游离型质粒 整合型质粒（复制子不能被宿主识 别，带有同源片段） 1.2.6 按照功能： 基因克隆质粒（筛选系统，MCS） 基因表达质粒(筛选系统，MCS，启动子，
已知大肠杆菌的 F质粒、 R1、 R100、 ColV、 Collb-P9、 R6k、 RP4 等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒 也有38kb。 G+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外，很多都 是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有2kb左右。 自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同， G+细菌 中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒分子量较小。
有限制性内切酶位点，便于基因组装
有对载体进行筛选的标记或报告基因
1. 质粒载体 ★
1.1 质粒的定义 ★
质粒是染杂色体外能进行自主复制的遗传单位，由J.莱德伯 格在1952年提出。
共生生物、真核生物的细胞器DNA和细菌染色体以外的单纯的DNA分子 某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。
这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时， 出现不同的迁移速率，超螺旋构型最快，其次是 线性构型，开环构型最慢。
线性质粒
Hale Waihona Puke 发卡线性质粒：在两端均有反向重复 序列，形成共价闭合的发卡环 多肽结合质粒：5’端与多肽连接，同时 两末端还具有反向重复序列，多为放线菌 质粒 这些结构可以防止质粒被降解
荧光素酶在氧化底物荧光素（luciferin）的过程中，会发出生物荧 光，可以通过荧光测定仪或液闪仪测定荧光强度。可以极其灵敏、高效 地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作 用的一种检测方法。
蓝白斑筛选(互补筛选）原理 ★
载体携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个
pT181, pC221, pUB112, pE194 pS194, pC223,
革兰氏阳性细菌
pBC110, pBC16 pSN2, pE12, pIM13
1.6 质粒的复制方式
（1）θ型复制 单向复制 双向复制
革兰氏阴性细菌中多数质粒是以θ型 方式复制，R1，R100等是单向复制 ，F，R6k等是双向复制类型。
质粒上的par区段编码分配蛋白，质粒上还有par蛋白的结合序列（inc区）
负超螺旋密度的增加可以使质粒分配更稳定，par 区可以增加负超螺旋密 度，DNA促旋酶则降低分配稳定性。 (partition region）
质粒多聚体也导致分配不稳定：
质粒多聚体含有多个复制起点，其复制速度是单体的数倍， 将导致大量细胞只含有多聚体质粒而影响分配稳定性
酵母的杀伤质粒(killerplasmid)已知是RNA分子。
1.2 质粒的分类 ★
1.2.1 按照复制性质： 严紧型质粒:带有与分配有关的基因，由DNA聚合酶Ⅲ复 制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，1～2个/ 细胞； 松弛型质粒:由DNA聚合酶Ⅰ复制，当染色体复制停止后 仍然能继续复制，数十～数百个/细胞
ColIb-P9, R144, R483, R64, R621a
革兰氏阴性细菌
R69, R466b R46, R15, N3, pKM101 R16, R723
RP1, RP4, R68, R751, R690, RK2
RSF1010, pKT212, pKT230, pGSS
R7K, R388, pSA747 R6K