流式抗体及荧光染料的选择
流式细胞术中应用的荧光染料介绍
流式细胞术中应用的荧光染料介绍流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数细胞的技术。
在流式细胞术中，荧光染料起着至关重要的作用，可以标记细胞的不同成分，使其能够通过流式细胞仪进行检测和分析。
荧光染料通过特定的荧光光谱来发出荧光信号，这些信号被流式细胞仪采集和分析，从而提供有关细胞类型、数量和功能的信息。
以下是几种常见的流式细胞术中应用的荧光染料的介绍。
1. FITC（Fluorescein Isothiocyanate）：FITC是最常用的荧光染料之一，通过与免疫球蛋白G（IgG）结合，可用于免疫细胞表面分子的检测。
FITC在波长为488 nm的激光下激发，发射的荧光信号在525 nm 左右。
它可以与其他荧光染料（如PE或APC）结合使用，以实现多参数流式细胞分析。
2. PE（Phycoerythrin）：PE是一种从红藻中提取的荧光染料，其发射的荧光信号在575 nm左右。
PE通常用于检测细胞表面的抗原或细胞内的蛋白质，如细胞因子。
PE也可以与其他染料结合使用，以实现多参数分析。
3. APC（Allophycocyanin）：APC是一种类似于PE的荧光染料，通过独特的发射波长（约于660 nm附近）和长的荧光寿命来区分。
APC适用于检测多种细胞表面分子和蛋白质，在深色的区域提供了可靠的信号。
5. PE-Cy7：PE-Cy7是PE染料与Cyanine 7（Cy7）结合形成的荧光染料。
它适用于多参数流式细胞术，利用其较长的荧光寿命和波长（激发于488 nm，发射于780 nm左右），可以与其他染料一起使用，以实现更多的细胞表面和内部分子的检测。
除了上述染料外，还有很多其他的荧光染料可以用于流式细胞术。
例如，Alexa Fluor系列、eFluor系列、Brilliant Violet系列等。
这些染料具有不同的光谱特性和荧光强度，可以根据实验需要选择合适的染料。
需要注意的是，在选择荧光染料时，需考虑染料的互相干扰问题和流式仪的激发和检测系统。
流式常用荧光染料概要
如何选择流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料有很多种,我们如何来选择流式细胞仪测定的常用荧光染料呢？
首先要考虑，他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也不同,选择荧光染料时，必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长做为重点考虑。
发射光波长，如：氩离子气体激光管,它的发射光波488nm；
氦氖离子气体激光管发射光波长633nm；
488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）；
PE（藻红蛋白）
PI（碘化丙啶）
CY5（化青素）
preCP(叶绿素蛋白)
ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。
激发光和发射光波长，如下：
流式细胞仪中常用的荧光染料光学特征以及需要的激光器
流式•细胞仪交流论坛：/forum-181-1.ht ml
荧光染料谱。
经验总结：流式抗体选择秘诀
对于奋斗在科研一线的实验党来说，流式真是恨得牙齿直痒痒。
恨，是因为流式实在是坑太多，一堆的CD分子已经把人搞的晕头转向，又有电压、补偿、液流、滤光片、PMT这些概念傻傻分不清楚，而流式抗体怎么选择，再怎么搭配更是让人开始怀疑人生……经验总结：流式抗体选择秘诀由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。
因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。
1，流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。
2，流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。
在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。
因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。
3，流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。
以某仪器为例：PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。
FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。
用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。
如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道，流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。
各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
如实验者同时检测三个指标，可以在下图中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。
切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。
因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。
常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。
4，同型对照的选择：流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。
cik流式检测标准
cik流式检测标准流式检测是一种常见的分析方法，通过将样品以液体形式通过流式细胞仪进行连续检测，可以快速、准确地获得样品中各种细胞的数量、类型及其相关信息。
Cik即Checks in the Kitchen的缩写，是一种流式检测标准，旨在规范流式细胞仪的操作和数据分析，提高流式检测的准确性和可重复性。
Cik流式检测标准的主要内容包括以下几个方面：仪器校准、样品制备、试剂选择、数据获取和数据分析。
下面将分别对这些方面进行详细讨论。
仪器校准是确保流式细胞仪正常工作和数据准确性的重要步骤。
在进行流式检测之前，需要校准仪器的光源、流速、压力等参数。
光源的校准要求使用标准颜色球或荧光微粒，根据其颜色和荧光信号调整仪器的光谱和增益。
同时，也需要检查流速和压力的稳定性，确保流式细胞仪的流速和施加压力在正常范围内。
样品制备是流式检测的关键步骤之一。
样品制备要求样品细胞以单个细胞为单位，在流式细胞仪采集之前进行适当的分散处理。
分散处理可以通过酶消化、机械分散等方法来实现，以确保样品中的细胞能够均匀分散，并且不会影响细胞的形态和功能。
此外，对于复杂样品，如全血样品，还需要进行红细胞溶解处理，以避免红细胞对后续流式检测结果的干扰。
试剂选择是流式检测中的重要环节。
在选择试剂时，需要根据实验目的和样品特性来确定合适的标记抗体、荧光染料和控制物质。
标记抗体和荧光染料的选择应考虑到其与目标细胞表面抗原的亲和力和特异性，以及其在流式细胞仪中的检测灵敏度和稳定性。
控制物质的选择应确保其与待检测样品相似，以提供准确的负对照和阳性对照。
同时，还需要对试剂进行质量控制，确保试剂的稳定性和纯度符合要求。
数据获取是流式检测过程中的核心环节。
在进行数据获取前，需要根据实验需求设置合适的检测参数，如激发波长、荧光通道和激光功率等。
此外，还需要根据样品特性和目标细胞的表达水平来确定数据采集时的事件数目，以确保获得足够的数据进行准确的分析和解释。
免疫细胞流式分选技巧
免疫细胞流式分选技巧一、标记抗体选择选择特异性识别目标免疫细胞的抗体是流式分选的第一步。
确保所选抗体与目标细胞表面抗原具有高亲和力和特异性结合的能力。
对于初次筛选，建议采用多参数标记，以便更准确地识别和区分不同细胞亚群。
二、细胞样本处理在开始流式分选之前，对收集的细胞样本进行适当的处理，包括离心、洗涤和重悬浮，以去除杂质和红细胞。
根据需要，可以采用特定的酶或化学物质对细胞进行消化或溶解，以促进抗体与细胞表面抗原的结合。
三、荧光染料选择选择适合激发波长和光谱特性的荧光染料，以确保在流式分选中获得最佳的信号强度和特异性。
荧光染料应与所用抗体结合，且荧光信号应与背景噪声具有良好的分离度。
四、流速和压力控制流速和压力是影响流式分选效果的关键因素。
过高的流速可能导致细胞无法充分与抗体结合，而过高的压力可能导致细胞变形或破裂。
根据所用仪器和抗体，合理设置流速和压力，以确保最佳的分选效果。
五、检测仪器校准定期对流式分选仪器进行校准，以确保数据的准确性和可靠性。
校准通常涉及使用已知细胞标准品来验证仪器性能，包括光电倍增管（PMT）的校准和流动池的清洁与校准。
六、数据分析与解读使用适当的软件对流式数据进行采集、分析和解读。
根据实验目的和抗体标记选择，可以采用不同的数据分析方法，如聚类分析、细胞计数、定量分析等。
正确解读数据并识别特定细胞亚群是流式分选的关键步骤。
七、阴性对照设置设置阴性对照是排除非特异性结合和背景噪声的重要步骤。
常用的阴性对照包括未标记细胞、同型对照抗体和荧光染料自发荧光。
通过比较实验组与阴性对照，可以更准确地评估目标细胞的特异性标记。
八、实验室内质控为了确保流式分选的稳定性和准确性，实施实验室内质控至关重要。
质控措施包括试剂质量控制、仪器校准、数据标准化以及实验室内比对等。
此外，应定期对流式分选结果进行验证，以确保数据的可靠性。
九、实验重复性验证重复性验证是评估流式分选实验可靠性的重要环节。
通过在相同条件下进行多次实验，可以评估实验方法的可重复性。
流式细胞分选抗体原理
流式细胞分选（Flow Cytometry Cell Sorting）是一种用于分离和纯化特定细胞亚群的技术，其中抗体起到关键的作用。
以下是流式细胞分选抗体的原理：
标记抗体选择：首先，需要选择合适的抗体来标记目标细胞或目标细胞表面的特定分子。
这些抗体通常与荧光染料或其他标记物结合，以使标记的细胞在流式细胞仪中可视化。
光散射和荧光检测：标记后的细胞通过流式细胞仪，其在通过激光束时会散射或发射特定波长的荧光信号。
光散射用于测量细胞的大小和复杂度，而荧光检测用于检测标记抗体的荧光信号。
细胞分选：流式细胞仪根据标记的细胞的特定荧光信号，通过流式细胞排序装置将目标细胞与非目标细胞进行分离。
分选过程通常基于细胞荧光信号的阈值设定，将目标细胞与非目标细胞分开。
细胞收集：经过分选的细胞会根据需要进行收集，以获取纯化的目标细胞亚群。
抗体在流式细胞分选中起到了关键的作用，通过与目标细胞表面的特定分子结合，实现对特定细胞亚群的分离和纯化。
这种技术在生物医学研究和临床应用中具有广泛的应用，可以用于研究细胞亚群的功能、分析疾病机制以及进行细胞治疗等领域。
流式抗体制备
流式抗体制备流式抗体制备是一种用于检测和分析细胞表面标记物的重要技术。
通过结合单克隆抗体和荧光染料，流式抗体制备可以提供对特定蛋白质在细胞表面的定量和定位信息。
本文将介绍流式抗体制备的原理、步骤和应用。
一、原理流式抗体制备的原理基于免疫学。
首先，需要选择适当的单克隆抗体，该抗体能够特异性结合到目标蛋白质。
然后，单克隆抗体与荧光染料结合，形成流式抗体。
荧光染料会发出荧光信号，用于检测和分析细胞表面标记物。
二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样品收集并制备成单细胞悬浮液。
2. 抗体选择：根据所需检测的标记物选择适当的单克隆抗体。
3. 抗体结合：将单克隆抗体和荧光染料按照比例混合，使其结合成流式抗体。
4. 抗体染色：将流式抗体加入细胞悬浮液中，使其与目标蛋白质结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体。
6. 流式细胞分析：使用流式细胞仪对样品进行分析，检测和定量目标蛋白质的表达水平。
三、应用流式抗体制备在许多生物学研究领域有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用示例：1. 细胞免疫表型：流式抗体制备可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达水平，从而帮助鉴定不同细胞类型和亚群。
2. 免疫治疗监测：流式抗体制备可以用于监测免疫治疗中特定免疫标记物的变化，以评估治疗效果。
3. 癌症研究：流式抗体制备可以用于检测和定量癌细胞表面标记物，从而帮助诊断和研究癌症。
4. 免疫疫苗研发：流式抗体制备可以用于筛选和评估潜在疫苗候选物的免疫原性。
总结流式抗体制备是一种重要的细胞分析技术，通过结合单克隆抗体和荧光染料，可以定量和定位细胞表面标记物。
该技术在细胞免疫表型、免疫治疗监测、癌症研究和免疫疫苗研发等领域有着广泛的应用。
随着技术的不断发展，流式抗体制备将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
流式配色及分析
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
精选2021版课件
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胞内因子的含量与检测效果
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
开源：刺激活化T细胞。方法有二：
1:PMA（PHA/LPS...)＋Ionomycin: PMA能自由透过细胞膜，因此能绕过细胞膜受体直接激活PKC; Ionomycin则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高； 只有PMA+Ionomycin联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法.
流式配色分析及实验设计
精选2021版课件
1
关于流式抗体
什么是荧光素
fitc pe
✓ 荧光素是具有荧光特性的染料 ✓ 只在特定波长激光照射后才发出自身荧光 ✓ 发出的精选荧20光21版颜课件色（波长）也是固定的 2
流式细胞技术：
在细胞分子水平上； 通过单克隆抗体； 对单个细胞或其他生物粒子； 进行多参数； 快速的； 定量分析。
红3
Pe-cy7
远红 4
Apc(AF647,ef660) 红 5
Apc-cy7(ApcH7,ef780)
远红 6
可以也仅可以最多选择8个荧光抗体去标 记抗原；
需要注意： 同一通道不可以选2种荧光抗体，例如： AF488，BB515,FITC 不可以同时使用；
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19
染料的亮度与抗原表达强度相匹配
Tertiary: 低水平表达，激活性marker，或者表达区 分不明显
Example: CD25
CD4 CD45RA
CD25
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影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合
越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响－pH、离子强度
比例性：抗原与抗体发生
可见反应需遵循一定的量比 关系
前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)：
抗原抗体比例合适
抗原抗体反应比例性示意图
阶段性
第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见
第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细 胞溶解等现象
❖ 影响抗原抗体反应的因素
一、反应物自身因素
抗原:理化性状、表位种类和数目 抗体:来源、特异性、亲和性、效价
二、环境因素
电解质: 生理盐水或缓冲液 酸碱度: pH6～pH9（pH7.2～pH7.4） 温 度: 15℃～40℃（4℃ ），37℃最适
流式抗体的选择、荧光染料应用
IVD
Ⅱ类体外诊断试剂
ASR
分析物特异性试剂
RUO
仅用于研究
❖ 单克隆抗体 ❖ 混合单克隆抗体 ❖ 多克隆抗体
•荧光直标的抗体 •未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进 行间接标记检测）
•单分子荧光素 •复合分子荧光素
信噪比（S/N）：特异性荧光信号（signal）与非特异性荧 光信号的比值
❖细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光 波长较长的荧光染料（如APC）可以得到较好的S/N比值。
理想荧光素
❖ 具有高的光子产量，信号强度高 ❖ 对激发光有较强的吸收，降低背景信号 ❖ 激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰 ❖ 易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记
流式抗体及荧光染料的选择
陈晓东 产品技术专员
1
抗原抗体反应
2 流式抗体的选择、荧光染料应用
抗原抗体反应
❖ 抗原抗体反应的原理 ❖ 抗原抗体反应的特点 ❖ 影响抗原抗体反应的因素
抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异 性结合反应。
❖ 抗原与抗体的特异性结合既会在体内发生，亦可以在体外进行， 体外进行的抗原抗体反应习惯上称作血清学反应
S/N越大，表 明阳性与对 照细胞的荧 光峰分离越 好，当S/N大 于3时属于可 接受范围
PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCP
综合因素：
❖荧光标记效率：抗体上标记荧光素的数量（E/P比值）也会影 响相对荧光强度。
❖抗体检测的抗原较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧 光素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细 胞群和何阴性细胞群的目的。
物得特异性 ❖ 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂的影响
❖根据仪器选用荧光素：1.每个通道只能选择1种荧光素 2.各个通道之间的荧光素可以随意搭配
❖搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小
注意：
1.不要为了节省荧光抗体，未经过预实验就按抗体说 明书减半量甚至更多进行标记。
2.不能完全凭感觉进行标记，需进行细胞计数。
抗原表位与抗体高变区间的互补结合
物 质 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合
基
抗原抗体之间的结合力
础
亲水胶体转化为疏水胶体
❖ 抗原抗体反应的特点
特异性
可逆性
比例性
阶段性
特异性：抗原与抗体结
合反应的专一性
分子基础:抗原表位与抗体分子 高变区之间空间构型的互补性
抗原抗体反应特异性示意图
可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件
3.应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因 为FITC的荧光特性是pH依赖的。
4.荧光抗体、荧光染色的样本应避免暴露于强光下。
5.建议尽快上机检测（最好24h内）。
陈晓东 产品技术专员