荧光染料

荧光染料简介

荧光定义

荧光染料会发出荧光，所谓荧光是指物质分子吸收紫外光后发出的可见光荧光以及吸收波长较短的可见光后发出的波长较长的可见光荧光。

荧光发生机理

每个分子具有一系列严格的分立能级，室温下物质分子大部分处于"基态"，当这些物质在光的照射下吸收光能后，进入新的状态，称为"激发态"。处于"激发态"的分子是不稳定的，它可以通过以10-9-10-7秒的极短时间内发射光量子回到基态。这一过程称为荧光发射，

也就是发光。

激发光谱和发射光谱

任何发荧光的物质分子都具有两个特征光谱--激发光谱和荧光发射光谱。

在测定时，用以激发荧光的吸收光谱，一般称为荧光物质的激发光谱，它是指相对于不同激发波长的辐射所引起物质发射某一波长荧光的光谱。

荧光发射光谱简称为发射光谱，是指某一波长激发光引起物质发射不同波长荧光的光谱。

荧光效率和荧光强度

分子能产生荧光必须具备两个重要的条件，一是物质的分子必须具有吸收一定频率光能的基团--生色团，二是必须具有能产生一定光量子的荧光团。

而物质发射荧光的能力用荧光效率表示。荧光效率为荧光团发射荧光的光量子数与生色团吸收的光量子数的比值称。

荧光效率往往小于1。如罗丹明B的乙醇溶液的荧光效率为0.97；荧光素的水溶液的荧光强度为0.65，荧光效率与物质结构有关，还与所处的环境紧密相关。而对于某种荧光

物质在特定的环境下它的荧光效率是固定的。

在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。即荧光强度（发射荧光的光量子数）等于吸收光强度乘以荧光效率。

提高荧光强度的根本方法

选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，和选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片作为激发滤光片，是提高荧光强度的根本方法。许多染料的最大吸收峰并不是

紫外光，而是在400nm-500nm的蓝绿光，所以紫外光不是这些染料的最佳激发光源，可

见光才是这些染料的最佳光源。

常用荧光色素波长

名称最大吸收波长（nm）最大发射波长（nm）适用性吖啶橙（Acridine orange）405585中吖啶黄（Acridine yellow）455620好碘化丙啶（Propidium iodide）488620中溴化乙啶（Ethidium bromide）488610中光神霉素（Mithramycin）457570好派若宁Y（Pyronin Y）488580好罗丹明123（Rhodamine 123）560540-660中赫斯特33258（Hoechst 33258）338505差荧光素（Fluorescein）495525好荧光黄（Lucifer yellow）428544好

伊红（Eosin）525546中四甲基罗丹明（Tetramethyl rhodamine）555580中SYBR GreenⅠ498522好SYBR Gold495540好SYPRO Orange475580好SYPRO Red545635中NBD467538好GelStar495530好黄色荧光蛋白EYFP515530好绿色荧光蛋白EGFP490510好蓝色荧光蛋白EBFP380440差

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

1、FITC（异硫氰酸荧光素）绿色：激发波长488nm，最大发射波长525nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL1通道检测；

3）可用于荧光显微镜技术

4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。

2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL1通道检测；

3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；

4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。

3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL2通道检测；

3）适用于荧光显微镜技术；

4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。

4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL4通道检测；

3）适用于荧光显微镜技术；

4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。

PI（碘化丙啶）：橙红色620nm

5、PE（藻红蛋白）橙黄色：激发波长488nm，最大发射波长575nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL2通道检测；

3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。

6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；

2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。

7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；

2）荧光强度高；

3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。

8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）不易湮灭；

3)可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。

9、PE-Cy5：激发波长488nm，最大发射波长670nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；

2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；

3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；

4)可与FITC、PE搭配，荧光干扰小、补偿小，但不宜与APC搭配。

5）与单核细胞和粒细胞非特异性结合多。

10、PE-Cy5.5：激发波长488nm，最大发射波长694nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；

2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；

3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；

4)可与FITC、PE、APC搭配，荧光干扰小、补偿小，是APC比较理想的搭配。

11、PE-Alexa Fluor 700：激发波长488nm，最大发射波长723nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）光淬灭性很强，要绝对避光。

12、PE-Cy7：激发波长488nm，最大发射波长767nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；

2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；

3）光淬灭性很强，要绝对避光；

4）可与FITC、PE搭配，与FITC无光谱重叠，与APC搭配荧光干扰小，补偿小，是比较理想的搭配。

13、TR：激发波长595nm，最大发射波长615nm。

1）其标记的抗体适用于配备Texas Red激光器的流式细胞仪；

2）荧光不易淬灭，可用于荧光显微镜。

14、APC（别藻青蛋白）红色：激发波长633/635nm，最大发射波长660nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；

2）在BD细胞仪的FL4通道检测，在Beckman Coulter细胞仪只有配备双激光器的FC500才能检测到。630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发