流式抗体的选择及美天旎新荧光染料的特点
流式细胞术中应用的荧光染料介绍
流式细胞术中应用的荧光染料介绍流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数细胞的技术。
在流式细胞术中，荧光染料起着至关重要的作用，可以标记细胞的不同成分，使其能够通过流式细胞仪进行检测和分析。
荧光染料通过特定的荧光光谱来发出荧光信号，这些信号被流式细胞仪采集和分析，从而提供有关细胞类型、数量和功能的信息。
以下是几种常见的流式细胞术中应用的荧光染料的介绍。
1. FITC（Fluorescein Isothiocyanate）：FITC是最常用的荧光染料之一，通过与免疫球蛋白G（IgG）结合，可用于免疫细胞表面分子的检测。
FITC在波长为488 nm的激光下激发，发射的荧光信号在525 nm 左右。
它可以与其他荧光染料（如PE或APC）结合使用，以实现多参数流式细胞分析。
2. PE（Phycoerythrin）：PE是一种从红藻中提取的荧光染料，其发射的荧光信号在575 nm左右。
PE通常用于检测细胞表面的抗原或细胞内的蛋白质，如细胞因子。
PE也可以与其他染料结合使用，以实现多参数分析。
3. APC（Allophycocyanin）：APC是一种类似于PE的荧光染料，通过独特的发射波长（约于660 nm附近）和长的荧光寿命来区分。
APC适用于检测多种细胞表面分子和蛋白质，在深色的区域提供了可靠的信号。
5. PE-Cy7：PE-Cy7是PE染料与Cyanine 7（Cy7）结合形成的荧光染料。
它适用于多参数流式细胞术，利用其较长的荧光寿命和波长（激发于488 nm，发射于780 nm左右），可以与其他染料一起使用，以实现更多的细胞表面和内部分子的检测。
除了上述染料外，还有很多其他的荧光染料可以用于流式细胞术。
例如，Alexa Fluor系列、eFluor系列、Brilliant Violet系列等。
这些染料具有不同的光谱特性和荧光强度，可以根据实验需要选择合适的染料。
需要注意的是，在选择荧光染料时，需考虑染料的互相干扰问题和流式仪的激发和检测系统。
美天旎公司磁珠分选产品
美天旎公司磁珠分选产品标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品一、MACS微珠（MicroBeads）MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。
微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。
微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。
MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用2 0－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。
此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。
MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。
其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。
多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。
这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。
MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠）二、MACS分选柱（Separation Column）MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。
在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。
手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。
此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。
BrilliantViolet多色流式介绍
496
515/30
Brilliant Violet BUV661
Bright
348
355
661
670/25
Brilliant VioletBUV737
Bright
348
355
737
740/35
Brilliant Violet BUV805
Dim
348
355
805
820/60
三、BD HorizonTM Brilliant Blue 515 （BB515）
5）BV 染料和 BD FACS Buffer 很好的兼容性保证能用于各种流式实验，无毒，适合做流式分选及活细胞成像
二、BUV家族BD Horizon Brilliant UltraViolet (BUV Family)
1、家族成员BUV395 BUV496 BUV737 BUV805荧光素图谱
2、各BUV荧光素信息详细介绍
3、BV421明星product介绍
BD Horizon BV421 的亮度相当于 PE 或 比 PE 还要亮，比 Pacific Blue 亮 10 倍
更亮，更好的分辨率，弱表达抗原的第一选择，让 Pacific Blue 通道变得wonderful
BV421染色案例数据
4、Brilliant Violettm 染料标记流式抗体优势
710/50
Qdot705, eFluor700NC
Brilliant Violettm786
Bright
407
405
786
780/60
Qdot800
Brilliant Violet tm450
Dim
404
美天旎流式
流式细胞仪 Flow Cytometer
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、 光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体 技术为一体的一种高科技仪器。
流式细胞仪的发展及商品化
1934 Moldavanl: First try ( 固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
如：Annexin V； 如：BudU掺入染色； 如：CFSE； 如：aldefluor；
流式细胞术临床应用（主要血液科、检验科）
淋巴细胞亚型分析(CD3/CD4/CD8/CD19/CD16CD56)； 白血病免疫分型； 白血病微小残留病灶MRD检测； 多发性骨髓瘤MM的检测； 骨髓增生异常综合征MDS的检测； 血红蛋白尿PNH的检测； 造血干细胞移植CD34干细胞检测； 强直性脊柱炎HLA-B27的检测； „„
一、流式细胞术基本原理
流式细胞术（flow cytometry，FCM）： ―细胞在流动的过程中检测细胞的各项指标。
流式抗体及荧光染料的选择
影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合
越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响－pH、离子强度
比例性：抗原与抗体发生
可见反应需遵循一定的量比 关系
前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)：
抗原抗体比例合适
抗原抗体反应比例性示意图
阶段性
第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见
第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细 胞溶解等现象
❖ 影响抗原抗体反应的因素
一、反应物自身因素
抗原:理化性状、表位种类和数目 抗体:来源、特异性、亲和性、效价
二、环境因素
电解质: 生理盐水或缓冲液 酸碱度: pH6～pH9（pH7.2～pH7.4） 温 度: 15℃～40℃（4℃ ），37℃最适
流式抗体的选择、荧光染料应用
IVD
Ⅱ类体外诊断试剂
ASR
分析物特异性试剂
RUO
仅用于研究
❖ 单克隆抗体 ❖ 混合单克隆抗体 ❖ 多克隆抗体
•荧光直标的抗体 •未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进 行间接标记检测）
•单分子荧光素 •复合分子荧光素
信噪比（S/N）：特异性荧光信号（signal）与非特异性荧 光信号的比值
❖细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光 波长较长的荧光染料（如APC）可以得到较好的S/N比值。
理想荧光素
❖ 具有高的光子产量，信号强度高 ❖ 对激发光有较强的吸收，降低背景信号 ❖ 激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰 ❖ 易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记
不知道分选柱该如何选择
不知道分选柱该如何选择？给你方案！美天旎的分选柱分几类，如MS、LS、LD级autoMACS column 等，那么，这些有什么区别呢，您在实验中又该如何去选择适合您的分选柱呢？首先，让我们来认识一下分选柱：美天旎的分选柱（Column）是MACS技术的核心，其特点如下：•填充有不同规格的铁珠，可分选或者去除10^7-10^10细胞；•表面亲水包被，不损伤细胞，同时保证流速；•可以将磁场放大1000-10000倍，因此只需极少的细胞表位被识别即可被磁场捕获，从而为后续实验预留足够抗原表位，如磁珠分选后的细胞无需切除磁珠即可直接染流式抗体，而不受影响。
我们知道，美天旎的MACS分选策略有阳性分选、去除分选，那我们就按两种分选策略来分析如何选择恰当的分选柱：一、阳性分选1、要分选的细胞数量：如下图所示：MS柱容纳的最大细胞上样量是2×10^8细胞（既包含阳性细胞又包含阴性细胞），而其能捕获的阳性细胞最多是10^7。
2、目的细胞是常见细胞还是稀有细胞为了在分选稀有细胞（表达频率〈5%）时得到较更高的纯度，您可以使用两个分选柱：用一根分选柱进行一次分选后，阳性成份再过一次新的分选柱。
3、大体积的细胞另外，如果您要分选的目的细胞是体积较大的特殊细胞，如原生动物细胞、人皮肤郎罕式细胞、鼻咽癌细胞、心肌细胞等，那推荐您使用Large cell column。
因为大细胞柱的铁珠间隙足够大，容许这些特殊的大体积细胞顺利通过。
二、去除分选去除分选中需要考虑以下几个因素：1您使用MACS isolation kits 或MACS microbeads吗？2 抗原表达强还是弱呢？3 您需要更高的纯度还是回收率呢？4 您需要分选多少细胞？根据这几个因素，您可以按下图的标识来选择合适的去除分选柱。
常用抗体荧光染料的选择
常用抗体荧光染料的选择随着免疫荧光技术的不断发展，荧光染料及其标记的抗体偶联物也被广泛的应用于生物学实验中。
目前，市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列(BIOTIUM, USA); Alexa Fluor®系列(Life technology, USA); DyLight系列; Cy系列; IR Dye系列等等。
使用最多的为Alexa Fluor®系列和CFTM系列。
一、CFTM系列染料的核心对比Alexa Fluor®系列具有以下几点优势：1、新型罗丹明核心罗丹明染料以优异的耐光性和良好的荧光量子产量著称。
因此很多Alexa Fluor®染料具有罗丹明核心结构，但是，传统罗丹明的化学结构很难从长波长的荧光染料延伸至远红外区域甚至是更具挑战性的近红外区域，而且生物偶联后其水溶性并不理想。
Biotium 科学家发现从绿色到近红外多色荧光的罗丹明染料的新型化学方法。
该方法被有效的应用于CF染料的产品中，尤其是远红外CF染料，而且通过这种方法制备的染料不仅水溶性极佳而且耐光性极好。
2、特异性高的近红外染料近红外染料最大的特点是比可见光范围要大很多，大滴的染料常会导致染料水溶性低、染料聚合体多、荧光量子产量差等问题。
为了解决这些问题，许多商用的近红外染料比如AlexaFluor®、DyLight®dyes和IRDyes®近红外染料，在制备时吸附了大量的带负电荷的磺化基团，其磺化作用可以在一定程度上会提高染料的溶解性和荧光性，但这样也带来了另一些更加严重的问题，经这种染料标记的生物耦联物的非特异性结合。
Biotium的科学家用革命性的方法设计出近红外染料CF，在避免引入大量负电荷的情况下，极大的保证了染料优异的理化特性。
Biotium 近红外的CF 染料以花青或罗丹明染料为核心结构，该核心结构的特殊化学修饰限制了染料的分子内位移，从而获得染料的高量子产率和更好的水溶性。
流式抗体选择
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。
2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。
3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。
4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。
5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。
5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。
6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
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染料光谱重叠最小化 •采用多激光激发减少重叠
•慎用偶联染料
•自发荧光多的选择用红激光
同型对照抗体选择： •同型对照抗体：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的 免疫球蛋白亚型 （Fc段相同，F（ab’）2段不同） •与染色的单克隆抗体：
①相同种属来源
②相同免疫球蛋白及亚型
blue emission green emission infrared emission infrared emission
Vio dyes ---Performance
• Laser and filter compatibility
• Enhanced brightness
• Decreased spillover
流式抗体的选择及美天旎 Vio系列新型荧光染料
德国美天旎生物技术有限公司
郝高克
一、荧光素的基本概念
•荧光的概念：
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
•荧光素的使用：选择正确的激光器；探测器（PMT）；
二、荧光信号的补偿
•什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 •为什么要进行补偿调节？
• Decreased spillover
• Photo-induced conjugate degradation
Thank You
Brighter, Better Compensation, and More Stable
Vio® Dyes: Brand name - not only for violet laser dyes! •VioBlue violet laser (405 nm) •VioGreen violet laser (405 nm) •PE-Vio770 blue or yellow laser (488 or 561 nm） •APC-Vio770 red or yellow laser (635 nm or 561 nm)
FITC PE
laser
PC5
400
500 520 575
600
700
665
三、流式实验中流式抗体的选择
准备工作： •确定实验要检测的marker
•选择合适的荧光素标记的抗体
•选择合适的同型对照抗体
Fluorescent Signals: Extrinsic Structural & Functional Parameters (fluorescent probe) •Surface receptors e.g. labeled antibodies •Viability e.g. Propidium iodide (PI), 7-AAD •DNA/RNA content e.g. PI / acridine orange (AO) •Total protein e.g. covalent or ionic bonded acid dyes •Lipids e.g. Nile red •Apoptosis e.g. Annexin V/PI •Intracellular proteins e.g. Cytokines, signal transduction molecules (labeled antibodies) •Enzyme activity e.g. fluorogenic substrates (aldefluor) •DNA synthesis e.g. BrdU staining (proliferation) •Proliferation e.g. CFSE
• High stability during fixation
• Photo-induced conjugate degradation
• Laser and filter compatibility
• Enhanced brightness
• High stability during fixation
③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 •用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产 生的背景染色
举例：双染实验
• 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同 型对照抗体分别染色 • n色分析就要制备n 个补偿对照管
四、The Vio® Dyes-新型荧光染料
荧光染料的选择：
•根据机器的设置
• Vio® Dyes: Brand name - not only for violet laser dyes!
– VioBlue violet laser (405 nm) blue emission – VioGreen violet laser (405 nm) green emission – PE-Vio770 blue or yellow laser (488 or 561 nm) infrared emission – APC-Vio770 red or yellow laser (635 nm or 561 nm) infrared emission