公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法
公共场所集中空调通风系统卫生规范WS-394-2012
WS 394-2012公共场所集中空调通风系统卫生规范《公共场所集中空调通风系统卫生规范》由卫生部于2012年9月19日卫通〔2012〕16号发布，自2013年4月1日起实施。
卫生部于2006年发布的《公共场所集中空调通风系统卫生规范》自2013年4月1日起废止。
前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由卫生部环境卫生标准专业委员会提出。
本标准由中华人民共和国卫生部批准。
本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、江苏省疾病预防控制中心、深圳市疾病预防控制中心。
本标准主要起草人：姚孝元、金银龙、刘凡、王俊起、戴自祝、张秀珍、于淑苑、孙波、金鑫、王艳、朱文玲、韩旭。
公共场所集中空调通风系统卫生规范1 范围本标准规定了公共场所集中空调通风系统（以下简称集中空调系统）的设计、质量、检验和管理等卫生要求。
本标准适用于公共场所使用的集中空调系统，其他场所集中空调系统可参照执行。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1 新风量air change flow单位时间内由集中空调系统进入室内的室外空气的量，单位为m3／（h·人）。
2.2 可吸入颗粒物inhalable particle matter悬浮在空气中，空气动力学当量直径小于等于10 μm，能够进入人体喉部以下呼吸道的颗粒状物质，简称PM10。
2.3 风管表面积尘量duct surface dust集中空调风管内表面单位面积灰尘的量，单位为g/m2。
3 设计卫生要求3.1 集中空调系统新风量的设计应符合表1的要求。
表1 新风量要求3.2 集中空调系统送风温度的设计宜使公共浴室的更衣室、休息室冬季室内温度达到25℃，其他公共场所在16℃～20℃之间；夏季室内温度在26℃～28℃之间。
3.3集中空调系统送风湿度的设计宜使游泳场（馆）相对湿度不大于80%，其他公共场所相对温度在40%～65%之间。
公共场所空调冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检测原始记录
9、菌型确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养：氧化酶(-/弱+),硝酸盐还原(一),尿素酶(一),明胶液化(+),水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。
培养基及试剂
实验步骤
1、样品的沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000 r/min离心1min去除。
2、样品的过滤：将经沉淀或离心的样品通过滤膜过滤，取下滤膜置于15mL灭菌水中，充分洗脱，备用。
3、样品的热处理：取1mL洗脱样品，置50℃水浴加热30min。
4、样品的酸处理：取5mL洗脱样品，调pH至2.2,轻轻摇匀，放置5min。项目编号样品Fra bibliotek称检测项目
嗜肺军团菌
环境条件
温度： ℃ 湿度： %
收样时间
检测时间
检测方法
嗜肺军团菌培养法
检测依据及方法
《公共场所卫生检验方法 第五部分：集中空调通风系统》GB/T 18204.5-2013（3）
主要仪器设备
生物安全柜BHC-1300ⅡA2（KLM-YQSB-002）、立式蒸汽灭菌器LDZM-60KCS-Ⅱ（KLM-YQSB-022）、二氧化碳培养箱BPN-150CW（UV）（KLM-YQSB-005）
10、结果报告：根据生化培养与血清学实验结果报告是否检出嗜肺军团菌。
观察时间
第一次：第二次：第三次：第四次：第五次：
第六次：第七次：第八次：第九次：第十次：
样品编号
GVPC平板培养
菌落验证
公共场所水环境中活嗜肺军团菌的快速检测方法
公共场所水环境中活嗜肺军团菌的快速检测方法郭沛;赵龙;胡翮【摘要】旨在建立一种基于16S rRNA前体的分子学检测方法用于快速检测活嗜肺军团菌,应用该方法与ISO标准法调查公共场所水环境中嗜肺军团菌的水平及污染现状.此研究方法的理论基础在于营养刺激后可诱导嗜肺军团菌16S rRNA前体的合成,后者可作为检测细胞活性的指标.分别应用预刺激RT-qPCR法和ISO法对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌以及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异性、灵敏度.应用预刺激RT-qPCR法和ISO法检测公共场所水环境中的嗜肺军团菌,比较两者结果的一致性.结果显示,预刺激时间大于3h时,嗜肺军团菌16S rRNA前体的增长缓慢,最佳预刺激时间设置为3h.预刺激RT-qPCR法与ISO法均能较好地检出嗜肺军团菌,特异性均为100％,预刺激法的最低检测浓度(Limit of detection,LOD)为102Cell/L,ISO标准法的LOD为104 Cell/L.预刺激法及ISO法的总阳性率分别为43.5％(30/69)和40.6％(28/69),两种方法的检出率差异无明显统计学意义(C2=0.119,P=0.730).预刺激RT-qPCR法是一种快速有效的检测活嗜肺军团菌的方法,诊断灵敏度及特异性高,是ISO标准法潜在的替代方案.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】7页(P203-209)【关键词】嗜肺军团菌;PCR;水环境;公共场所;16S rRNA;快速检测方法【作者】郭沛;赵龙;胡翮【作者单位】湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100;湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100;湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100【正文语种】中文军团菌病是一种细菌性疾病，主要表现为自限性非肺炎性庞蒂亚克热（Pontiac fever）和军团菌病症状，其特征是严重的呼吸道症状，包括具有高度致命性的肺炎。
公共场所卫生检验方法 第5部分：集中空调通风系统-最新国标
公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统1 范围本文件描述了公共场所集中空调通风系统中嗜肺军团菌、细菌总数、真菌总数、空调送风中β-溶血性链球菌、新风量、空调送风中可吸入颗粒物（PM10）、空调风管内表面积尘量和空气净化消毒装置的检测方法。
本文件适用于公共场所集中空调通风系统，其他场所使用的集中空调通风系统参照执行。
本文件中同一个指标如果有两个或两个以上检验方法时，根据技术条件选择使用，但以第一法为仲裁法。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.28 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18204.1 公共场所卫生检验方法第1部分：物理性指标GB/T 18204.2 公共场所卫生检验方法第2部分：化学性指标GB/T 18883 室内空气质量标准GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 34012 通风系统用空气净化装置3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
嗜肺军团菌Legionella pneumophila两端钝圆，有鞭毛，无芽孢和荚膜的革兰氏阴性杆菌，具有在含有L-半胱氨酸和三价铁盐缓冲液的活性炭-酵母提取液培养基上生长的特性，经生化试验和血清学试验鉴定确认的一种具有致病性的军团菌，是引起军团菌病的主要菌型。
细菌总数 total bacteria count在营养琼脂培养基上经36 ℃±1 ℃培养48 h所生长发育的嗜中温性需氧和兼性厌氧菌落的总数。
真菌总数 total fungal count在沙氏琼脂培养基上经28 ℃±1 ℃、5 d培养所形成菌落数。
β-溶血性链球菌β-hemolytic streptococcus能产生溶血素，血平板上在菌落周围形成界限分明、完全透明的溶血环（β-型溶血）的化脓（或A群）链球菌（Streptococcus pyogenes）和无乳（或B群）链球菌(Streptococcus agalactiae)。
嗜肺军团菌荧光定量PCR检测
嗜肺军团菌荧光定量PCR检测朱水荣;张政;卢亦愚;任红宇;扬仕贵;高晓萍【期刊名称】《中国公共卫生》【年(卷),期】2008(24)9【摘要】目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。
方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。
利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。
结果该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。
检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。
结论TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。
【总页数】3页(P1111-1113)【关键词】嗜肺军团菌;mip基因;TaqMan探针;荧光定量PCR【作者】朱水荣;张政;卢亦愚;任红宇;扬仕贵;高晓萍【作者单位】浙江省疾病预防控制中心微生物所,杭州310051;中国疾病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.嗜肺军团菌lvgA基因分析及实时荧光定量RT-PCR对军团菌的检测 [J], 单小云;胡野;应延风;屠平光2.嗜肺军团菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立 [J], 杜昕颖;黄留玉;苏晓;王玉飞;龚春丽;庄妤冰;苑锡铜;陈泽良;袁静;宋宏彬3.嗜肺军团菌荧光定量PCR方法的建立及在公共场所集中空调检测中的应用 [J], 冯华;刘雪林;张传福;史云;靳连群;王强;戚红卷;林彦峰;胡晓丰;董德荣4.嗜肺军团菌荧光定量PCR方法的建立及在公共场所集中空调检测中的应用 [J], 冯华; 张传福; 史云; 靳连群; 王强; 戚红卷; 林彦峰; 胡晓丰; 董德荣; 刘雪林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法 (2)
公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法1范围青岛精诚仪器仪表有限公司本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。
本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T18204.3公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物GB/T18204.5公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统3空气中嗜肺军团菌定量检测3.1原理采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。
3.2仪器和设备3.2.1微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。
3.2.2液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。
3.2.3便携式冷藏箱。
3.2.4冷冻离心机：温度4︒C。
3.2.5恒温水浴锅或金属浴：温度范围50︒C～99︒C。
3.2.6荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。
3.2.7卤素灯：500W。
3.2.8涡旋震荡器：调速范围0~3000rpm。
3.3材料和试剂3.3.1酵母浸出粉。
3.3.2蒸馏水。
3.3.3EMA固体粉：5mg/管。
3.3.4无核酸酶去离子水。
3.3.5矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。
3.3.6核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。
3.3.7引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。
嗜肺军团菌检测标准
嗜肺军团菌检测标准一、引言嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一种革兰氏阴性杆菌，是人类军团病的主要病原体。
军团病是一种由吸入含有嗜肺军团菌的气溶胶引起的急性呼吸道传染病。
为确保公共卫生安全，准确、快速地检测嗜肺军团菌成为防控军团病的关键环节。
本文将详细介绍嗜肺军团菌的检测标准，以期为相关领域提供有益的参考。
二、样本采集与处理1.样本采集：采集疑似军团病患者呼吸道分泌物、痰液、支气管肺泡灌洗液等样本。
采样时应遵循无菌操作原则，避免污染。
2.样本处理：将采集到的样本立即送至实验室，进行处理。
处理过程中，应对样本进行匀浆、离心等操作，以提取细菌。
三、实验室检测1.细菌培养：将处理后的样本接种于选择性培养基上，如BCYE培养基。
在35-37℃、5%二氧化碳环境下培养3-10天，观察菌落形态。
2.生化试验：对疑似菌落进行生化试验，如氧化酶试验、尿素试验、马尿酸盐试验等，以初步鉴定嗜肺军团菌。
3.分子生物学检测：采用PCR（聚合酶链式反应）等分子生物学技术对疑似菌落进行核酸检测，以确定嗜肺军团菌的存在。
PCR检测具有较高的灵敏度和特异性，可用于嗜肺军团菌的快速诊断。
四、结果判定与报告根据实验室检测结果，结合患者临床表现和流行病学史，进行综合判断。
如细菌培养、生化试验和分子生物学检测结果均符合嗜肺军团菌特征，可判定为嗜肺军团菌感染。
检测报告应包括患者信息、样本信息、检测方法和结果等内容。
五、质量控制与注意事项1.质量控制：实验室应建立严格的质量控制体系，包括定期校准检测设备、验证检测方法的准确性、参加室间质评等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
2.注意事项：在样本采集、运输、处理和检测过程中，应严格遵守生物安全规范，防止交叉感染和实验室感染。
同时，实验室人员应具备相应的专业技能和生物安全意识，确保检测工作的顺利进行。
六、总结与展望本文详细介绍了嗜肺军团菌的检测标准，包括样本采集与处理、实验室检测、结果判定与报告以及质量控制与注意事项等方面。
嗜肺军团菌的检测
深圳市空调冷却塔水军团菌污染状况调查摘要:目的了解深圳市宾馆、大型写字楼、地铁等各类建筑物的空调冷却塔水军团菌污染状况。
方法随机采集中央空调冷却塔水样品并进行细菌培养和鉴定，再以聚合酶链式反应（PCR）等方法加以验证。
结果共采集水样28件，分离到1株军团菌，经鉴定为嗜肺军团菌Lp1型。
结论深圳市中央空调冷却塔存在军团菌的污染，需引起重视，防止军团菌病发生。
关键词:军团菌;嗜肺军团菌;冷却塔;污染状况Detection of Legionella pneumophila in cooling tower water of central air conditioning system in Shenzhen City.ZHANG Ran，CHEN Gui-bing，SHI Xiao-lu，et al.（Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）Abstract:Objective To investigate the contamination status of cooling water of central air conditioning syatem with Legionella pneumophila in in hotels，buildings and subways in Shenzhen City. Methods Cooling tower water samples from central aircondi-tioning system were randomly taken，cultured and then Legionella pneumophilia was isolated.Pobymerase chain reaction（PCR）was used for confirmation of the differentiation. Results Twenty-eight cooling water samples were collected and a strain of Legionella pneumophilia serovar Lp1was isolated. Conclusion The water in cooling tower of central air conditioning system in Shenzhen City has been contaminated with Legionella pneumophilia and measures be taken for preventing infection with Legionella pneumophilia.Key words:Logionella;Leginella pneumophilia;Cooling tower;Contaminationstatus军团菌是引起军团菌病的一种急性呼吸道传染病的病原体，于1977年在美国首次发现并证实。
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公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法1 范围本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。
本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18204.3 公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物GB/T 18204.5 公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统3 空气中嗜肺军团菌定量检测3.1 原理采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。
3.2 仪器和设备3.2.1 微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。
3.2.2 液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。
3.2.3 便携式冷藏箱。
3.2.4 冷冻离心机：温度4︒C。
3.2.5 恒温水浴锅或金属浴：温度范围50︒C～99︒C。
3.2.6 荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。
3.2.7 卤素灯：500W。
3.2.8 涡旋震荡器：调速范围0~3000 rpm。
3.3 材料和试剂3.3.1 酵母浸出粉。
3.3.2 蒸馏水。
3.3.3 EMA固体粉：5mg/管。
3.3.4 无核酸酶去离子水。
3.3.5 矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。
3.3.6 核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。
3.3.7 引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。
3.3.8 探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。
3.3.9 标准品质粒。
3.3.10 荧光定量PCR反应体系。
3.3.11 离心管：1.5mL透明离心管和1.5mL棕色离心管。
3.3.12 离心管：15mL，50mL。
3.4 样品的采集3.4.1 采样吸收液成分：酵母浸出粉12 g蒸馏水1000 mL3.4.2 采样吸收液制法：将酵母浸出粉（3.3.1）12g加蒸馏水至1000mL，121 ℃下高压灭菌15 min，每20mL采样吸收液分装于灭菌后的50mL离心管（3.3.12）中备用。
3.4.3 采样点：室内空气按GB/T18204.3中6.4.1规定，集中空调送风按GB/T18204.5 中9.5.1规定。
3.4.4 将装有采样吸收液的离心管置于便携式冷藏箱（3.2.3）中送到现场，开始采样前将采样吸收液（3.4.2）20mL倒入微生物气溶胶采样器（3.2.2）中，然后用吸管加入矿物油（3.3.5）1滴~2滴。
3.4.5 将微生物气溶胶浓缩器（3.2.1）与微生物气溶胶采样器（3.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。
3.4.6 按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3~2m3；并记录环境温度、大气压力和总采气体积或采样流量、采样时间。
3.4.7 采集的样品倒入离心管置于便携式冷藏箱中避光保存，4h内送实验室检验。
3.5 样品处理方法与条件3.5.1 样品的离心浓缩：将采集的气溶胶样品（3.4.7）于4℃下8000×g离心20min（3.2.4），小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的透明离心管中，再次4℃下8000×g离心20min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。
3.5.2 EMA母液{ρ[C21H18BrN5]=10mg/mL}的制备：取1管5mg EMA固体粉（3.3.3），短暂离心后加入0.5mL灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。
颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，每100μl分装于1.5ml棕色离心管（3.3.11）中，-20℃避光保存。
3.5.3 EMA工作液{ρ[C21H18BrN5]=100μg/mL}的制备：取10μlEMA母液(3.5.2)加990μl灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。
颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，置于1.5ml棕色离心管中。
每1000μl的EMA工作液可处理70份左右样品，EMA工作液现用现配，使用前计算好所需EMA工作液量。
3.5.4 样品避光孵育：取0.5mL经过离心浓缩的气溶胶样品（3.5.1）置于1.5mL透明离心管中，铝箔包裹以便避光。
加入13μLEMA工作液（3.5.3），反复颠倒，混合均匀，短暂离心收集管壁液体，4℃避光孵育5min。
3.5.5 样品光照活化：去掉包裹离心管的铝箔，将离心管水平放置在碎冰上，调整样品与卤素灯（3.2.7）的距离，使其垂直距离为15cm，光照5min。
光照阶段需混匀样品1次~2次，使光照均匀，防止样品过热。
3.5.6 样品存放：光照结束后，4℃保存样品，24h内提取核酸。
3.6 样品核酸提取由于样品核酸提取的条件与操作步骤因使用试剂盒的不同而有差异，所以应根据所使用的核酸提取试剂盒的操作手册进行操作。
附录A所列的空气中嗜肺军团菌核酸提取操作步骤是一个实例。
3.7 荧光定量PCR条件与扩增步骤3.7.1 标准品系列制备：将标准品母液（3.3.8）以十倍梯度依次稀释，在107copies/mL～102copies/mL浓度范围内制备十倍梯度稀释的标准品系列。
稀释方式举例如下：取10μL浓度为X×107copies/mL的标准品母液，编号为①，加入90μL无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×106copies/mL，编号为②；取10μL浓度为②的标准品，加入90μL 无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×105copies/mL编号为③；以此类推。
3.7.2 扩增体系：每次检测包括至少5个连续浓度标准品，每标准品至少进行3个复孔检测。
每次检测包括阳性和空白对照各一个。
样品进行3个复孔检测。
荧光定量PCR扩增体系（25μL）：其中2×RealMasterMix 10μL，上下游引物(10μmol/L)各1.25μL，探针(10μmol/L)0.625μL，20×Probe Enhance Solution 1.25μL，模板2μL，ddH2O 8.625μL。
3.7.3 扩增条件：94℃预变性4min；然后94℃变性20s，60℃退火延伸60s，61s检测荧光信号，进行40个循环。
3.7.4 数据处理：标准曲线相关系数R2>0.99，标准曲线斜率在-3~-3.5之间，扩增效率E 在0.9~1.2之间。
根据标准曲线和样品Ct值计算样品核酸中嗜肺军团菌浓度(copies/mL)。
3.8 结果报告3.8.1 采气体积换算：按式（1）换算成标准状态下采气体积。
00273P P t T V V t ⨯+⨯= （1） 式中： V 0 — 标准状态下的采气体积，单位为立方米（m 3）；V t — 实际采气体积，为采样流量与采样时间乘积，单位为立方米（m 3）；t — 采样点的环境温度，单位为摄氏度（℃）；T 0 — 标准状态下的绝对温度，273K ； P — 采样点的大气压，单位为千帕（kPa ）；P 0 — 标准状态下的大气压，101kPa 。
3.8.2 浓度计算：空气中存活的嗜肺军团菌浓度按式（2）计算。
001.0V C C ⨯=（2）式中： C — 空气中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每立方米（copies/m3）；C0 — 样品核酸中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每毫升核酸（copies/mL ）； V0 — 标准状态下采气体积，单位立方米（m3）。
3.9 方法性能本方法最低检出空气中嗜肺军团菌核酸浓度为102copies/mL 。
当采气体积为2m 3时，最低检出空气中嗜肺军团菌浓度为5 copies/m 3。
4 水样品中嗜肺军团菌定量检测4.1 分离培养法4.1.1 原理集中空调冷却水、沐浴水、景观水、娱乐用水等水样品经浓缩后，接种于GVPC 琼脂平板生成单个军团菌菌落，并在BCYE 琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE 琼脂平板上不生长，进一步经血清学实验鉴定确认为嗜肺军团菌，依照样品量、加标回收率等定量计算得出水样品中嗜肺军团菌浓度。
4.1.2 仪器和设备4.1.2.1 CO 2培养箱：5% CO 2，35℃~37℃。
4.1.2.2 微生物过滤系统。
4.1.2.3 恒温水浴箱：50℃±5℃。
4.1.2.4 生物安全柜。
4.1.2.5 光学显微镜。
4.1.2.6 平板振荡器、涡旋振荡器。
4.1.2.7 具塞采样瓶：容积 500mL。
4.1.3 材料和试剂4.1.3.1 硫代硫酸钠溶液[c(Na2S2O3)=0.1mol/L]。
4.1.3.2 滤膜：孔径0.22µm。
4.1.3.3 酸处理液[c(HCL-KCL)=0.2mol/L]：pH 2.2±0.2。
4.1.3.4 GVPC琼脂平板。
4.1.3.5 BCYE琼脂平板。
4.1.3.6 BCYE-CYE琼脂平板(L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板)。
4.1.3.7 军团菌分型血清。
4.1.3.8 氯化钠溶液[ρ(NaCL)=0.85%]。
4.1.3.9 具塞试管。
4.1.3.10 灭菌水。
4.1.4 样品采集4.1.4.1 将贝具采样瓶（4.1.2.7）用前灭菌。
4.1.4.2 每瓶中加入硫代硫酸钠溶液（4.1.3.1）0.3mL~0.5mL。
4.1.4.3 采样点按GB/T 18204.5中3.5.3规定。
4.1.4.4 无菌操作采集水样500mL。
4.1.4.5 采集的样品2d内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不应超过15d，尽快及时进行实验室检测。
4.1.5 检验步骤4.1.5.1 样品预处理：水样品如有杂质可静置去除沉淀，将样品通过0.22µm孔径的微生物过滤系统（4.1.2.2）过滤，取下滤膜剪碎置于10mL原样品中，涡旋振荡器（4.1.2.6）充分振荡洗脱，取洗脱液备用。
4.1.5.2 样品酸处理：取1mL预处理后的样品（4.1.5.1）于无菌具塞试管（4.1.3.9）中，加入适量酸处理液（4.1.3.3），使样品pH值至2.0~2.2，轻轻摇匀，处理时间5min~10min。