抗血清的制备(实验)
抗血清的制备
抗血清的制备在资讯栏目看到有关免疫血清的制备，跃跃欲试，希望能够和大家分享一下我关于抗血清的制备的实验，希望高手可以指点指点．(一)实验目的(1)了解抗血清制备的基本原理。
(2)掌握抗血清制备的操作步骤及方法。
(二)实验原理用具有抗原性的物质注入健康动物机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经一定次数注射，使血清中的抗体组达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离出血清，从而获得抗血清。
为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。
本次实验是用颗粒性抗原(苏云金芽胞杆菌鞭毛及菌体抗原)制备相应的抗血清，这类抗原的免疫原性较强，不需加入佐剂也能获得特异性强、效价高的抗血清。
（三）实验器材(1)活材料：1)苏云金芽胞杆菌醋螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp.galleria血清型H5ab)、加拿大变种(Bacillus thuringiensis var.canadensis 血清型H5ac)、库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki血清型H3abc)未知血清型的苏云金芽胞杆菌。
2)动物家免(大耳白，2—3kg),健康雄性或未孕雌免。
(2)培养基：供试培养基的配方如表1所示。
表1 三种培养基配方培养基培养基配方牛肉膏/% 蛋白胨/% 氯化钠/% 琼脂/% pH值软琼脂培养基1.0 1.0 0.2 0.5 7.2摇瓶培养基1.0 1.0 0.2 / 7.2斜面培养基1.0 1.0 0.2 2.0 7.2(3)器材：注射器(5Ml)、针头(5号、12号)、剪刀、胶布、纱布、离心管、止血钳、刀片、l0mL吸管、带橡皮塞无菌试管、平皿、接种环、100mL三角瓶(带橡皮塞)、量筒、小动物解剖台、青霉素瓶、镊子、甲醛、碘酒棉球、酒精棉球、干棉球、麦氏比浊管、生理盐水等。
免检实验设计 抗血清的制备
抗体的制备——多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血(1)动物的选择选择什么动物来免疫取决于：*所需抗血清的量-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
*能供免疫用的抗原量g足够，而山羊需要几毫克。
-小鼠50(1)动物的选择(续)*动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2)佐剂(adjuvant)*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。
佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。
因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:-弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)-弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant, FIA)*是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant, FCA)*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法*研磨法：适于制备大量的佐剂抗原-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
抗血清制备 - 添加
抗血清制备抗原以常规的方法免疫家兔或小鼠获得相应的抗血清为多克隆抗体，不同的抗原和不同的动物，其免疫途径及抗原用量和免疫程序存在一定的差异，但步骤及方法大致类似。
初次免疫时，纯化的病毒以生理盐水稀释，与等量的弗氏完全佐剂进行乳化使之形成油包水乳剂，再次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，最后一次注射不需要佐剂乳化。
一．佐剂乳化将抗原（如病毒）按注射剂量用生理盐水稀释后加入等量的佐剂，漩涡震荡20min,超声波200w,工作时间2s,间歇时间10s,处理2-3次，取出20ul,滴到冰水混合物上，如果油滴三分钟内不扩散，则说明乳化成功。
二．免疫流程实验室437小鼠注射量按照60μg-60μg -60μg -90μg。
三．取血一般第三次免疫后隔两周采血，取阴性血清胃对照，以1/200 μg/μl浓度的病毒抗原包被，利用ELISA测其效价。
血清初次的稀释可按1/100 1/1000 1/10000 1/10000.....如果效价较低可按流程再加强免疫一次。
取血可用间断式割尾法或一次性摘眼球法，取后将血置于37℃保温1h,然后5000rpm 离心10min,取上清，加入万分之一的叠氮化钠-60℃保存。
腹腔注射【定义】：腹腔注射是将药物注入胃肠道浆膜以外，腹膜以内．其吸收速度较快（2小时左右）。
【适应症】：人不常应用，有时可以作为特殊治疗手段，如多巴胺、速尿联合腹腔注射治疗肝硬化顽固性腹水。
当猪只较小而难以寻找耳静脉时，或天冷皮肤血管收缩或猪处于贫血消瘦情况血管不明显时，可以通过腹腔注射补液．以防脱水死亡，因下痢脱水1/3以上即有生命危险．【操作步骤】：小鼠腹腔注射腹腔注射是常见的给药方式，尤其是在麻醉时。
常见的麻醉方法均是麻醉药物腹腔注射。
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。
2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。
这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。
抗血清 的制备
抗血清的制备抗血清制备是一种常见的免疫学实验技术，用于检测特定物质的存在和数量。
下面将对抗血清制备的原理、步骤及注意事项进行详细介绍。
一、原理抗血清是由动物免疫某种抗原制备得到的一种免疫血清，其中包含了特异性抗体。
抗血清制备的原理是通过注射一定量的特异性抗原到动物体内，使其产生特异性抗体，然后收集抗血清。
二、材料和试剂1.抗原：需要制备抗血清的特定抗原。
2.兔、小鼠等动物。
3.盐酸：用于调整兔抗血清的pH值。
4.取血器：用于采集动物血液。
5.离心管、离心机：用于收集血清。
6.不含菌的容器：用于保存抗血清。
三、步骤根据实验要求，制备特定抗原，可以是蛋白质、细胞、病毒、细菌等。
2.制作与抗原相应的抗体兔/小鼠选择适宜种类的动物，注射免疫原，隔一段时间后，在动物体内试验特异性抗体的出现，出现后即可采血制血清。
一般来讲，兔子被认为是制备抗血清的最佳动物，而小鼠常常会出现交叉反应。
3.采集兔血液注射完最后一次免疫原后一周左右，在一个清洁的容器上臂处用取血器采血2-3ml。
离心采集到的兔血液，定量将其分离出血清，再加入盐酸，调节pH值，即可得到兔抗血清。
5.评价抗血清的质量评价抗血清的质量，主要是通过测定抗体滴度来判断抗血清的特异性和强度。
四、注意事项1.严格控制免疫原和免疫过程，确保抗原和抗体的特异性和纯度。
2.合理选择免疫动物种类，不同种类免疫动物会对抗原产生不同反应。
3.采血时要注意安全和卫生，防止感染病毒和细菌。
4.在制备抗血清的过程中需要注意保护动物的健康和福利，并严格按照实验室安全规范操作。
抗血清制备
抗血清制备抗血清是一种广泛应用于医学、生物学、农业等领域的重要抗体。
它可以通过对动物实验的刺激来制备，具有较高的特异性和灵敏性。
本文将介绍抗血清的制备过程和应用领域。
一、抗血清的制备抗血清的制备需要对动物实验进行免疫刺激，让其产生免疫反应，生成相应的抗体。
制备抗体的方法有多种，包括:1. 多次免疫法：将抗原与适当的佐剂混合后注射给动物，每次注射间隔时间大于1个星期。
免疫周期主要根据抗原型以及免疫状态来确定。
一般情况下，需要多次免疫才能达到所需的浓度。
2. 单次免疫法：在抗原一侧布局NMDA表达杂交的细胞，给兔子单偏免疫或初免疫后再进行免疫，以提高抗体效价。
3. 聚集物制备法：将抗原加入雄鹰蛋白中，然后注射到家兔或小猪体内，以选育出抗体。
以上三种方法都有它们的优缺点，适用于不同的条件下。
二、抗血清的应用抗体在医学、生物学、农业等领域都有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 诊断：通过抗血清与疾病相关物质的特异性结合可以进行诊断，如HIV、狂犬病、乙肝等病毒感染的检测。
2. 治疗：抗体被广泛应用于治疗各种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病、传染病等。
3. 细胞学：抗体可用于细胞学实验，用于检测细胞内、细胞表面或细胞核内的成分，如检测肿瘤细胞、细胞分离、特定蛋白识别等。
4. 农业：抗血清可用于畜牧业和农业生产，如检测动物或植物病毒感染、食品中添加的污染物等。
三、注意事项在制备抗血清时，需要注意以下几点：1. 选择优质的抗原，并进行适当的保护、存储。
2. 用药量应适当，尽量不要过多。
3. 对免疫动物的饲养和体温要求高。
4. 在注射时要注意卫生和安全问题，防止交叉感染。
5. 制备后需要进行充分的检测和鉴定，以确定抗体的特异性和效价。
抗血清的制备是一项重要的实验技术，应用领域广泛，但同时也需要谨慎和责任心。
只有严格遵守操作规定和注意事项，才能制备出优质的抗血清，促进科学的发展。
抗血清的制备
抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
免疫学实验论文——抗血清的制备及效价测定
免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。
采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。
免疫血清的制备实验报告
3.获得免疫血清
1）将采集的动脉血放到37℃温箱中，静置1小时。
2）在4℃冰箱内放置6-8小时，待血清析出。
4.在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。
六、教师评价
2.在暴露颈动脉的手术过程中，应保持切口在正中位置，因此固定大白兔时就要注意。为了减少出血量，因此皮肤、黏膜、肌肉要一层层剪开同时用止血钳扩开，在肌肉层最好用手指撕开，以免剪刀丰富的血管造成过量出血。
3.放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。
实验报告
实验名称
多克隆抗体的制备一（抗血清制备）
实验日期
院系
专业
班级
姓名
学号
一、实验目的
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。
二、实验器材
试剂：
酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂
器材：
兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱
3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。
4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。
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• “4+”很强，全部RBC凝集，凝集块全部沉 于 管底，液体澄清。 • “3+”强，RBC大部分凝集并沉于管底，液 体稍混浊。 • “2+”中等强度，RBC大约一半凝集，液体 较混浊。 • “+”弱，仅少量RBC凝集，液体明显混浊。 • “--”不凝集，液体混浊与对照管相同。 • 只要待测血清管出现“2+”以上的凝集现象， 即可判断为反应阳性；以出现“2+”凝集的 最大稀释度为待测血清的抗体效价。
• 4、取两支小试管并以A、B标记之，将上述
血清一半加入A管，另一半加入B管。将A
管置于56℃水浴箱30分钟（灭活补体）。
• 5、抗血清效价的鉴定。 • 凝集试验和溶血反应
凝集反应
实验原理
指颗粒性抗原(RBC)与相应抗体特异结 合，在适当电解质存在下，形成肉眼可 见的凝集现象。
试管凝集试验过程
试验有何不同？
• 2、取上述RBC悬液1ml免疫家 兔。免疫部位：静脉、皮内、皮 下等。每只兔子免疫8~10点， 每点0.1ml左右。每隔2~4天免 疫一次。
1班免疫时间表
每隔2天免疫一次
2班免疫时间表
每隔3天免疫一次
3班免疫时间表
每隔4天免疫一次
• 3、心脏采血10ml，凝固后，分离血清 （2000转/min,5分钟)。
200
200
200
200
弃去
RBC
200
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200
200
200
200
终稀 释度
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64 1/128 1/256
--
观察结果时，应先观察对照管结果是
否正确。对照管应不溶血，在对照管结果
全部正确前提下观察待测血清管的结果，
以出现完全溶血作为抗体的效价。
思考题 • 溶血反应与补体结合
4.向每管加入200ul 2%RBC悬液，此时
每管的液体总量为400ul ，血清稀释度 又增加1倍。 5.摇匀，置37 ℃ 30min。(取出试管 1500r/s 30秒)观察结果。
试管凝集操作程序(倍比稀释法)
单位：uL
管号 生理盐 水 血清 RBC 终稀释 度 1 2 3 4 5 6 7 8对照
论文式实验报告
• • • • 六、讨论 1.1 1.2 1.3 对实验结果解释和评价
论文式实验报告
• 七、参考文献
期刊：著者．文章名．刊物名称，卷或
年(期)：文章的起讫页码
书籍：编著者．书名．版本．出版地：
出版者，年份
一、颗粒性抗原的制备 （2%~5%RBC的制备）
• （1）静脉采血2-3ml，注入抗凝管中， 轻轻混匀。 • （2）洗涤RBC 将上述抗凝血移至 10ml试管中，加入NS 6-7ml，混匀， 2500r/min离心5min,去上清。重复上 述操作三次，最后一次去上清后，将红 细胞配制成2%~5%的RBC悬液。
1.取洁净小试管8支，排列于试管架 上，依次编号。
2.向各管中加入生理盐水200ul。
3.向第一支试管中加入A管血清200ul，充分 混匀，吸出200ul放入第二管，混匀后取出 200ul加入第三管中，如此类推直至第七管， 混匀后取出200ul弃去。第八管不加血清， 为生理盐水对照管。至此，第1~7管的血清 稀释度分别为：1：2，1：4，1：8……1： 128。这种稀释方法称为连续倍比稀释法， 为免疫试验中常用的稀释方法。
4.向每管加入200ul 2%RBC悬液，此时 每管的液体总量为400ul ，血清稀释度 又增加1倍。 5.摇匀，置37 ℃ 30min。观察结果。
溶血反应操作程序(倍比稀释法)
管号 生理 盐水
血清
单位：uL
7 8对照
1
2
3
45Biblioteka 6200200
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200
弃去
200 --
[结果判断]
• 选择适当的光暗对比背景，先不要振摇，观 察管底凝集物的范围和上清液的浊度。然后 轻轻摇动试管，注意观察凝集颗粒的大小、 均匀度等。每一试管的观察，都应与对照管 进行比较。盐水对照管诮无凝集现象，轻轻 摇动试管则RBC分散成均匀混浊；而凝集块 则沉于管底，轻摇时不易散开，凝集程度通 常以“+”表示：
论文式实验报告
• 三、引言(前言)引言是论文正文的开场 白
• 1、引起读者对本论文的兴趣。
• 2、为读者提供理解本论文所需的背景资 料。
论文式实验报告
• • • • • • 四、材料与方法材料 1、实验对象 2、实验材料 3、实验分组 4、实验过程和方法 6、数据处理等内容。
论文式实验报告
• 五、结果： • 结果是实验研究成果的结晶
• 每个组交一份实验方案（3-4个同学一组）
论文式实验报告
• 一、题目的选择 • 1、准确、具体、简洁、醒目，使人一目 了然，引起重视 • 2、作者与单位(班级)，并注明所在班级 和指导教师姓名。 • 3、摘要和关键词 摘要是对论文主要内 容和观点的概括
论文式实验报告
• 二、关键词 • 又称主题词或索引词，一篇论著(论文) 一般选用2～5个关键词
溶血试验
实验原理
• 溶血反应是指补体参与的抗体 致红细胞的溶解反应.
• 参与反应的成分有红细胞、抗红
细胞抗体，也称溶血素、补体。
溶血反应实验过程
1.取洁净小试管8支，排列于试管架 上，依次编号。
2.向各管中加入生理盐水200ul。
3.向第一支试管中加入血清200ul，充分混匀， 吸出200ul放入第二管，混匀后取出200ul 加入第三管中，如此类推直至第七管，混匀 后取出200ul弃去。第八管不加血清，为生 理盐水对照管。至此，第1~7管的血清稀释 度分别为：1：2，1：4，1：8……1： 128。这种稀释方法称为连续倍比稀释法， 为免疫试验中常用的稀释方法。
综 合 性
实
验
免疫血清的制备
刺激机体
• 原理：抗原
刺激机体
产生
抗体
抗 血 清 制 备 的 基 本 流 程
选择合适的抗原 分离纯化抗原 选择免疫动物 确定免疫方案和程序 免疫动物 采血分离血清
抗血清的纯化与鉴定
设计实验方案的设计
• • • • • • 1.设计本实验的理由（实验目的）。 2.实验方案设计。 3. 可行性（理论、人员、实验条件等）。 4.创新性。 5.本实验要解决的主要问题。 6.预期目标。