第十二章制备型高效液相色谱技术生物制药工艺学

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高效液相色谱法 PPT课件

①固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论（solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理：朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点：灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样气相流动相液相流动相气相柱温液相柱温
气体、容易转
气体、常用氢气液体、、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节高效液相色谱法的主要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈

生物制药工艺学

生物制药工艺学一、离心技术1. 制备超离心三种转子P3182. 制备超离心三种离心方法P3203. 沉降速度和沉降系数 P328 ①沉降速度：即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。

②沉降系数：即物质粒子在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。

一般所说沉降系数为S 20,w 。

4. 分析超离心的两种方法 P331 Svedberg 方程式：测分子量实质是用不同方法测其沉降速度。

原理测量量沉降速度法根据沉降速度测出沉降系数以推出分子量。

界面位移量与离心时间。

沉降平衡法特定平衡下,离心力与扩散力平衡，液面浓度为0，池底浓度为2c 。

任意两位移处的浓度。

5. 超离心的其他两种应用P334①对生物大分子的均一性估计；②生物分子形状、大小及水合度的判断。

二、膜分离技术1. 各向同性膜与各项异性膜P341①各向同性膜：厚度大，孔隙为圆柱体。

流速低，易堵塞。

②各向异性膜：1）正反两面结构不同：功能层是孔径一定、薄的“皮肤层”，支持层为孔隙大得多、更厚的海绵层；2）喇叭口滤膜，孔隙为圆台形。

2. 截留分子量P343分子量截留值是指阻留率达90%以上的最小被截留物质的分子量。

3. 浓差极化现象P346超滤是在外压作用下进行的。

外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留在膜表面，并逐渐形成浓度梯度，产生浓差极化现象。

✘害处：引起流速下降、影响膜的选择透过性。

✔解决方法：振动、搅拌、错流、切流等技术。

4. 五种微孔滤膜P3555. 三种测微孔滤膜孔径的方法P3566. 微孔滤膜的应用P361①mRNA的测定以及纯化：使用硝酸纤维膜吸附与mRNA配对的DNA单链，然后将放射性mRNA样品溶液过膜使目的mRNA与DNA单链配对结合。

最后洗涤游离RNA，并用胰核糖核酸酶处理除去残留RNA。

②环状DNA的纯化环状DNA链打开后，变为一条环状链和一条单链。

用硝酸纤维膜结合单链，而环状链过膜，即可纯化得到环状单链DNA。

制备型高效液相

制备型高效液相
制备型高效液相色谱是一种快速, 有效的分析分离工具。本文介绍了制备型高效液相色谱基础理论及基本装置, 介绍了样品的预处理和应用实例, 分析了目前制备型高效液相色谱技术存在的问题并对该技术未来的发展进行了展望。
2018/8/20
高效液相色谱分析法
High performance liquid chromatography
2. 3色谱柱相对于分析型色谱, 制备色谱的核心就是色谱柱。为提供既稳定又高效的色谱柱, 并用小尺寸颗粒进行填充, 最常用也是最易实现的效果较为理想的是动态轴向压缩柱 ( DACTM )技术[ 9] 。DAC技术为使用者提供了用任一种填料自己装填色谱柱、方便快速地调整柱长度的可能性。在制备型HPLC中, 色谱柱的内径可在100 ~ 500mm 之间。一般增大色谱柱的直径意味着可以承载更多的样品, 从而增加产量。增加色谱柱的长度则意味着可加入的样品量和分辨率的增大, 但同时也增加了柱压。研究表明对于难分离物系, 可以采用直径较小的色谱填料, 以提高分离效率, 但在分离度可以满足分离要求的前提下, 使用较大直径的色谱填料将更为有利[ 10• • • • • • • • •
1基础理论人们对色谱基础理论进行不懈的研究, 提出了众多的理论。其中比较著名的有: 1. 平衡色谱理论。在1940 年由 W ilson[ 3] 提出, 该理论认为在整个色谱过程中, 组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成; 2. 塔板理论。在 1941年由M a rtin和Syng e[ 4]提出, 该理论将色谱过程比拟为蒸馏过程, 把色谱柱看成是由一系列平衡单元! 理论塔板所组成。在每一个塔板高度内, 组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成; 3. 纵向扩散理论。由Am undson[ 5] 等人通过大量实验提出, 该理论认为在色谱过程中, 组分在流动相的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素, 而有限的传质速率对区域谱带扩张没有影响; 4. 速率理论。该理论认为组分在流动相和固定相之间有限的传质速率是影响色谱区域谱带扩张的主要因素, 而轴向扩散的影响可以忽略; 5. 双膜理论。Funk等人把流动相和固定相看成是两块相互紧密接触的平面薄膜, 整个传质阻力为流动相膜的传质阻力和固定相膜的传质阻力所构成, 组分在界面接触处达到分配平衡。

第十二章讲义高效液相色谱

高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相固定相粒度（μm）固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm）柱内径（cm）柱入口压强（ kg/cm2 ）柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g）分析所需时间（h）装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、分
药品、多糖、高聚物、农药、
子量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等分析，大多是通过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加不溶于水非极性
非离子极性
溶于水离子
吸附
分配
反向分配
正向分配离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度等都是克服柱后展宽的途径
第二节高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置

12生物制药工艺学习题集制备型高效液相色谱技术

第十二章制备型高效液相色谱技术一、填空1制备型高效液相色谱的重要参数：、、、2色谱介质按分离机理分为、、、、、3蛋白质分离的主要依据有、、、。

二、选择题1用UV检测器进行多肽检测时常用的检测波长为：（）A 214nmB 320nmC 450nmD 500nm2在高效液相色谱中,六通阀属于 ( )A. 进样系统B. 分离系统C. 检测系统D. 数据处理系统三、名词解释1容量因子：2分离度：四、问答题1 制备型HPLC与分析型HPLC的主要不同点是什么？2简述制备型高效液相色谱常见问题及解决办法3一般来讲在设计分离方案时应考虑哪些事项？第十二章制备型高效液相色谱技术（答案）二、填空1分离度、分离速度、回收率、样品载量2反相色谱、正相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱。

3分子量、等电点、疏水性、结构特异性。

二、选择题1（A ）2 ( A )三、名词解释1是色谱分析中的重要参数，定义为溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。

当色谱柱、溶剂和分离温度一定时，容量因子为常数。

2在色谱分析中,表示各组份之间分离程度的参数.其定义为相邻两色谱峰保留值之差与峰底宽之和一半的比值.2121)(2)(211212W W t t W W t t R r r r r +-=+-=四、问答题1 （1）输液泵不同：两种泵设计的特点及其性能（2）检测器中的检测池不同（3）色谱柱不同：主要是色谱柱的直径大小不同以及填料的粒径的大小不同（4）制备色谱一般配有电导检测器和pH 值检测器分析型色谱没有（5）制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有2（1）待分离成分呈单一主峰（2）不易分开的两组分（3）目的组分含量少3 （1）产品的最终用途是什么?（2）那种原材料可以得到？怎样对它进行预处理? （3）在原材料中那种杂质可能会影响产品的纯度? （4）哪些杂质必须彻底除去?（5）产品的最终生产规模是多大?（6）在整个生产过程中哪些方面费用高?（7）我们可能得到和应用的仪器有哪些?。

制备型高效液相色谱的实验方法

第ｌ０卷
第４期
实验科学与技术
ＥｘｐｒｍｅｉｎｅａｄＴｅｈｏｏｙｅｉｎｔＳｃｅｃｎｃｎｌｇ
ＶｏＩ０Ｎｏ４．１．Ａｕ．ｇ２０１２
２１０２年８月
制备型高效液相色谱的实验方法
Ａｂｔａｔｒｐｒｔｅｈｇｅｆｒｎｅｌｕｄｃｒｍａｏｒｐｙｈｓｂｅｉｅｙａｐｉｄｉｄｃｎ，ｆｅｃｅｃｌａｄｆｏｓｒｃ：Ｐｅａａｉｉｈｐｒｍａｃｑｉｈｏｔｇａｈａｅｎｗｄｌｐｌｎｍｅｉｉｅｉｈｍｉａｎｄ，ｐｒｉｕｖｏｉｅｎｏａｔ－ｅｌｌｐｌａｌｅａａｅｈｇｄｅａｕｄｈｇｕｔｒｄｃｓＴｉｐｐｒｎｒｄｃｄｔｅｅｐｒｎａｈｎｆｒｐｒｔｅｈｇｒａｙａｐｉｂｅｔｓｐｒｔｉｈａｄｄｖｌｅａＪｈｐｒｙｐｏｕｔ．ｈｓａｅｔｕｅｘｅｍｅｔｅｃｉｇｏｅａａｉｉｈｃｏｎｉｉｏｈｉｔｐｖｐｒｒａｃｉｕｄｃｒｍａｏｒｐｙｉｅａａｉｎｏｏｏｈｒｌｘｌｒｄｈｗｔｅｐｔａｈｎｏｔｎ，ａｄｔｅｗａｓｏｍｐｏｉｇｅｏｆｍｎｅｌｉｈｏｔｇａｈｎｓｐｒｔｆｔｃｐｅｏ，ｅｐｏｅｏｏｓｔｕｅｃｉｇｃｎｅｔｎｈｙｆｉｒｖｎｑｏｓｄｎｓｂｌｉｓｔａｙｅａｄｓｌｅｐｏｌｍｓＴｈｔｄｎｓａｐｉａｉｎａｉｔｓｗｒｔｅｇｈｎｄｔｅｔａｉｔｏａｌｚｏｖｒｂｅ．ｅｓｔｅｔｐｌｔｌｉｅｅｓｒｎｔｅｅ．ｕｉｅｎｎ，ｃｏｂｉｅＫｅｒｓｐｅａａｉｅｈｇｅｏａｃｉｕｄｃｒｍａｏａｈ；ｅｐｒｎ；ｔｃｐｅｏ；ｍｅｈｄｙｗｏｄ：ｒｐｒｔｉｈｐｒｒｎｅｌｉｈｏｔｇｐｙｖｆｍｑｒｘｅｍｅｔｏｏｈｒｌｉｔｏ

01396生物制药工艺学.doc

01396生物制药工艺学.doc湖北省高自考考试大纲课程名称：生物制药工艺学课程代码：01396（理论）第一部分课程性质与目标一、课程性质与特点该课程是，是一门涉及生物学、医学、药学、生物技术、化学和工程学等学科基本原理的综合性应用技术科学。

使学生了解生物药物的来源及其原料药物生产的重要途径和工艺过程，掌握生物药物的一般提取、分离纯化原理与方法，了解各类生物药物的结构、性质、用途和生产方法、生产工艺原理与过程。

通过本课程的各个教学环节的学习，学生应具备生物药物研究、生产、开发的基本知识、基本理论与基本技能，并且具有应用现代生物技术研究、开发生物药物的初步能力。

二、考核知识点与考核目标（一）细胞破碎的方法及原理（重点）识记：常用细胞破碎的方法理解：细胞破碎的方法和各自特点、适用范围应用：举例说明不同生物材料的细胞破碎方法（二）生物材料的预处理（次重点）识记：凝聚作用和絮凝作用的概念理解：细胞培养液的预处理方法和相关原理，去除杂蛋白和金属离子的方法和原理应用：影响絮凝效果的主要因素（三）了解液固分离的方法和设备（一般）识记：过滤和离心分离的概念理解：影响液固分离的因素有哪些应用：错流过滤的使用特点；碟片式离心机的类型和特点第四章萃取分离法一、学习目的与要求掌握溶剂萃取的基本原理，萃取方式，破乳化方法；熟悉萃取设备和溶媒回收方法掌握超临界萃取的原理，影响因素；了解超临界萃取方式及流程掌握双水相萃取原理和影响因素了解反胶束萃取原理及其在生化药物分离纯化中的应用二、考核知识点与考核目标（一）萃取法的基本原理（重点）识记：溶剂萃取法、双水相萃取、反胶束萃取、超临界流体萃取的概念理解：各种萃取方法的特点应用：举例说明不同萃取法的应用（二）溶剂萃取法的操作方式（次重点）识记：乳化和破乳化的概念理解：影响溶剂萃取的因素应用：破坏乳状液的方法（三）超临界流体萃取在生物制药领域的应用（一般）识记：超临界萃取概念理解：超临界萃取的原理和影响因素应用：超临界萃取方式及流程和超临界流体萃取在药品生产中应用第五章固相析出分离法一、学习目的与要求掌握盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法等固相析出分离方法的原理和特点，以及影响因素。

制备液相色谱技术(LC-MS)

高效制备液相色谱技术
高效制备液相色谱的原理：
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的，那就是色谱理论。
但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的。制备型色谱：要求纯度、产量和收益。
经典的制备色谱方法与高效制备液相色谱的异同及优缺点：
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扩散
扩散使峰（谱带）变宽，严重削弱了色谱的分辨（分离）能力。
谱带变宽与流速成反比，与管线长度和管线内径成正比。
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三种不同管径的扩散影响
所以，制备液相色谱中更应注意缩短管路的长度，减
少202不1/10必/10 要的死体积。
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各种类型的制备液相展示
什么时候使用浓度过载?
什么时候使用体积过载?
一般情况下，由于需要有较大的 throughput，所以浓度过载使用较多，但当样品浓度过稀，又没有合适的方法浓缩时或流动相溶解样品的能力较17
由分析型色谱如何扩展到制备型色谱？
扩展计算
扩展计算
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高效制备液相色谱流路示意图
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两个问题：
1、延迟体积校正 2、扩散影响
什么是延迟体积？
理想情况下，当检测器检测到组分信号时，同一时刻，组分也被馏分收集器收集到。
实际情况下，这是做不到的，因为存在一个延迟体积。
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第十二章制备型高效液相色谱技术
一、填空
1制备型高效液相色谱的重要参数：、、、
2色谱介质按分离机理分为、、、、、
3蛋白质分离的主要依据有、、、。

二、选择题
1用UV检测器进行多肽检测时常用的检测波长为：（）
A 214nm
B 320nm
C 450nm
D 500nm
2在高效液相色谱中,六通阀属于 ( )
A. 进样系统
B. 分离系统
C. 检测系统
D. 数据处理系统
三、名词解释
1容量因子：
2分离度：
四、问答题
1 制备型HPLC与分析型HPLC的主要不同点是什么？
2简述制备型高效液相色谱常见问题及解决办法
3一般来讲在设计分离方案时应考虑哪些事项？
第十二章制备型高效液相色谱技术（答案）
二、填空
1分离度、分离速度、回收率、样品载量
2反相色谱、正相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱。