制备型高效液相

制备型高效液相
制备型高效液相色谱是一种快速, 有效的分析 分离工具。本文介绍了制备型高效液相 色谱基础理论及基本装置, 介绍了样品的 预处理和应用实例, 分析了目前制备型高 效液相色谱技术存在的问题并对该技 术未来的发展进行了展望。
2018/8/20
高效液相色谱分析法
High performance liquid chromatography
2. 3色谱柱 相对于分析型色谱, 制备色谱的核心就是色谱柱。为提 供既稳定又高效的色谱柱, 并用小尺寸颗粒进行填充, 最常 用也是最易实现的效果较为理想的是动态轴向压缩柱 ( DACTM )技术[ 9] 。DAC技术为使用者提供了用任一种填料 自己装填色谱柱、方便快速地调整柱长度的可能性。在制备 型HPLC中, 色谱柱的内径可在100 ~ 500mm 之间。一般增 大色谱柱的直径意味着可以承载更多的样品, 从而增加产 量。增加色谱柱的长度则意味着可加入的样品量和分辨率 的增大, 但同时也增加了柱压。研究表明对于难分离物系, 可以采用直径较小的色谱填料, 以提高分离效率, 但在分离 度可以满足分离要求的前提下, 使用较大直径的色谱填料将 更为有利[ 10• • • • • • • • •
1基础理论 人们对色谱基础理论进行不懈的研究, 提出了众多的理 论。其中比较著名的有: 1. 平衡色谱理论。在1940 年由 W ilson[ 3] 提出, 该理论认为在整个色谱过程中, 组分在流动 相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成; 2. 塔板理论。在 1941年由M a rtin和Syng e[ 4]提出, 该理论将色谱过程比拟为 蒸馏过程, 把色谱柱看成是由一系列平衡单元! 理论塔板所 组成。在每一个塔板高度内, 组分在流动相和固定相之间的 分配平衡能瞬间达成; 3. 纵向扩散理论。由Am undson[ 5] 等人 通过大量实验提出, 该理论认为在色谱过程中, 组分在流动 相的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素, 而有限 的传质速率对区域谱带扩张没有影响; 4. 速率理论。该理论 认为组分在流动相和固定相之间有限的传质速率是影响色谱 区域谱带扩张的主要因素, 而轴向扩散的影响可以忽略; 5. 双 膜理论。Funk等人把流动相和固定相看成是两块相互紧密接 触的平面薄膜, 整个传质阻力为流动相膜的传质阻力和固定 相膜的传质阻力所构成, 组分在界面接触处达到分配平衡。
2018/8/20
制备分离的色谱模型和分析分离的模型相似, 但在具体 操作中两者的指导思想却有着本质的不同。在制备分离中, 人们总是希望在尽可能短的时间里得到尽可能多的纯组分。 欲得到负载必须以分离效果为代价, 即在保持最低分辨率的 前提下, 使柱子超载以得到最大的物料通过量。而分析分离 中在最短时间里得到最大的分离效率则是人们希望得到 的[ 6] 。制备分离选择的是高柱效、高柱容量的色谱柱, 而且 简单大男 使色谱柱在超载状态下工作。所谓超载 , 通常将理论塔板数 下降10%时柱容量[ 7]。较为理想的制备条件的选择包括上 柱量, 容量因子, 选择性以及柱效[ 8]。
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2. 1输液泵 在制备型HPLC 不需要具有很高的输送压力, 一般为 19. 6MPa。输液泵采用的是恒流的机械往复泵或恒压的气动 放大泵较理想, 因为它们具有较高的输送速率和连续输出溶 剂的能力。然而当采用装入小颗粒固定相的粗柱进行制备 型HPLC时, 例外地需用能提供较大压力的泵。在某些场 合, 所需压力高达150bar, 此时采用薄膜泵较合适。对于内 径较小的制备柱可使用分析型的输液泵, 内径较大的制备 柱, 输液泵所需的输送能力可从分析型柱子所做的实验条件 参数计算出来。
一、液相色谱仪器
流程图
近年来, 从自然资源中寻找具有生物活性化合物的探索 工作日益受到人们的关注。人们在运用高效的筛选方法, 从 植物、海洋生物及微生物中发现新的先导化合物的同时需要 一个快速、有效的分离方法以分离目标化合物, 而色谱技术 是迄今人类掌握的对复杂混合物分离效率最高的一种方法, 能够分离物化性能差别很小的化合物[1] 。分析型H PLC 技 术一经出现就引起广大研究者, 特别是分析化学工作者的高 度重视, 使这项技术在分析应用方面取得了巨大成功。现在 随着人们大规模分离的需要, 制备型高效液相色谱技术也相 应产生了, 并受到了人们越来越广泛的重视。在我国, 该技 术已被列入������ 863 工程生物技术领域的攻关项目中[ 2]。由 于 技术上的原因, 长期以来制备型液相色谱技术发展缓慢, 但 是随着理论研究的深入, 新颖的填料、新的填充方法以及在 仪器和流程上的进展, 近年来该技术获得了很大的发展。
• 2. 2进样系统 • 在制备型H PLC分离中, 可以采用一个进样阀(如六通 • 进样阀) 将较大量的样品方便的注入柱子而不影响流动相 流 • 动。通过更换样品环可以方便的改变进样量, 最大可达 • 10mL。如果使用注射器, 一般采用停留进样技术, 即样品在 • 常压下注入, 然后再从新起动泵。若样品量非常大, 可以采 • 用停留技术, 借助于一台小体积泵将样品定量地注入柱中 。 • 也可采用隔膜进样法, 用注射器将样品定量地注入柱中。
• 2. 4检测器
在现有的检测器中, 示差折光检测器通常适用于制 备分 离, 不过在某些系统中为了准确地检测样品中所有 峰, 往往 需要将示差与紫外分光光度检测器配合使用。也 可用薄层 色谱对高浓度的流出液各流分进行检测, 所以当其 他检测方 法不适用时, 可求助于薄层色谱检测
2018/8/20
2 基本装置 制备型H PLC是一种基于组分在固定相( 柱填料) 和流 动相(淋洗液)中分配系数的微小差异, 当二相作相对运动 时, 样品中的各组分将形成不同的迁移速度的谱带而实现分 离的新型高效分离技术。对于制备型HPLC而言, 装置不像对分析 型HPLC那样关键, 使用不很高级, 价格较低的装置 往往可以获得令人满意的分离效果。 制备型HPLC装置主要由输液泵、进样系统、色谱柱、检 测器、馏分收集器、数据采集与处理系统等部分组成。