浅述酶底物法快速测定地表水中总大肠菌群与大肠埃希氏菌
酶底物法测定水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌综合试卷解析及答案
一、填空题1．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌(粪大肠菌群)时，需要取 ml水样，在±℃培养 h。
①②答案：100 36 1 242．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，呈现色为阳性。
①答案：黄3．采用固定底物技术酶底物法定性测定大肠埃希氏菌，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，将呈现——色的水样在暗处用波长为__ ___nm的紫外灯光照射，如果有产生则表示有大肠埃希氏菌存在。
②答案：黄 366 蓝色荧光4．采用固定底物技术酶底物法定量测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，水样加入培养基摇匀后，需倒入51孔或97孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以，然后用封口。
①②答案:赶除孔穴内气泡程控定量封口机二、判断题1．总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生乒半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。
( )①答案：正确2．采用固定底物技术酶底物法测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌可以定性测量，也可以定量测量。
( )①②答案：正确3．采用固定底物技术酶底物法可在48h判断水样中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌及含有的总大肠菌群和大肠埃希氏菌的最可能数值。
( )①②答案：错误正确答案为：应该是24h。
三、问答题采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌时，采用正确步骤培养后的样品，怎样判断大肠埃希氏菌的数值?②答案：采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌，采用正确步骤培养后的样品，观察51孔或97孔无菌定量盘，将变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nm的紫外灯光照射，如果有蓝色荧光产生则表示该定量盘孔穴中有大肠埃希氏菌存在，计算有荧光反映的孔穴数，对照MPN表即可查出大肠埃希氏菌最大可能数(MPN)，结果以MPN／100m1表示；如所有孔未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。
基于两种方法对水中总大肠菌群和 大肠埃希氏菌检测的对比论述
基于两种方法对水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测的对比论述摘要：本文围绕两种方法对水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测的对比问题展开分析与探讨，首先阐述试验材料仪器准备以及试验操作方法，然后从适用性、灵敏度、稳定性以及均一性四个方面入手，对实验结果进行总结与讨论，仅供参考。
关键词：总大肠菌群；大肠埃希氏菌；检测1 材料与方法1.1 材料与仪器实验所需材料包括：MMO-MUG培养基（由美国DEXX公司提供）；乳糖蛋白胨培养基（由青岛海博生物技术有限公司提供）；EC-MUG培养基（由青岛海博生物技术有限公司提供）。
实验所需仪器包括：培养箱（工作温度区间为36.0±1.0℃，44.5±0.5℃）；紫外灯照射仪（工作波长为366.0nm）。
1.2 方法利用MMO-MUG培养基以及乳糖蛋白胨培养基对水中总大肠菌群进行检测，利用MMO-MUG培养基以及EC-MUG培养基对水中大肠埃希氏菌进行检测。
准备侵袭性大肠埃希氏菌培养物、加标水样、含菌水样、适用性菌株（包括宋内氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、以及奇异变形杆菌）、MMO-MUG培养基粉末（称取剂量2.7±0.4g）的，根据要求制备乳糖蛋白胨培养液以及EC-MUG培养基。
1.2.1 适用性实验取前期制作备用MMO-MUG培养液、乳糖蛋白胨培养液以及EC-MUG培养液，称取剂量为10.0mL/管，分别注入试验菌混悬液。
MMO-MUG培养液以及乳糖蛋白胨培养液在36.0±1.0℃培养箱内进行培养，维持24.0h后对培养结果进行观察；EC+-MUG培养液在44.5±0.5℃培养箱内进行培养，维持24.0h后对培养结果进行观察。
1.2.2 灵敏度实验侵袭性大肠埃希氏菌培养物经24.0h培养后制备为0.5麦氏度菌液，经10倍梯度稀释处理，在菌量1500.0MPN/100mL~1.0MPN/100mL区间范围内进行试验，平行试验2次对结果进行统计，以观察不同细菌浓度条件下两种检测方法在灵敏度方面的差异。
酶底物法快速测定地表水中粪大肠菌群实验研究
粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分,主要来自粪便。
在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。
用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开,使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群,从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。
现阶段,粪大肠菌群检测最常用的方法是多管发酵法和滤膜法。
但是这两种方法测定的时间都很长,至少需要48h ,步骤繁琐,需要验证试验,同时无菌操作对实验室硬件设施的要求非常高。
而固定底物酶底物法分析1个样品在实验室内操作的时间仅需要1min ,培养时间也缩短为24h ,在普通实验室内就能进行。
酶底物法能抑制200万个异样细菌,精确检测到每100mL 样品中的1个粪大肠菌群。
1实验部分1.1仪器与试剂主要仪器与试剂详见表1。
表1主要仪器与试剂一览表酶底物法快速测定地表水中粪大肠菌群实验研究敬小兰,文丽娜,库永刚(庆阳市环境监测站,甘肃庆阳745000)摘要：采用酶底物法测定地表水中的粪大肠菌群具有操作简便,快速,结果稳定,与多管发酵法相比,两种方法具有强相关性,无统计学意义上的差异,满足环境监测技术要求。
关键词：酶底物法;快速测定;粪大肠菌群中图分类号：X830.2文献标识码：A文章编号：(甘)LK000067(2019)01-06-08-03Rapid determination of fecal coliform in surface water by enzymeJing Xiaolan ,Wen Lina ,Ku Yonggang(Qingyang Environmental Monitoring Station,Qingyang 745000,China)Abstract:Enzyme substrate method for the determination of fecal coliform bacteria in surface wateris simple,rapid and pared with multiple -tube fermentation method,these two methods have strong correlation but no statistical difference,and meets the technical requirements of environmental monitoring.Key words 院enzyme substrate method;rapiddetermination;fecal coliforms收稿日期：2018-11-07作者简介：敬小兰(1977—),女,甘肃省庆阳市环县人,工程师,从事环境监测及监测质量管理工作。
酶底物法系统
西安立科环保科技有限公司水质大肠菌群酶底物法检测系统介绍一、检测用途：酶底物法测定用途：用于检测水中总大肠菌群粪大肠菌群（耐热大肠菌群）和大肠埃希氏菌。
可用于检测水的类型：饮用水、水源水、废水、食品水、地表水、地下水、海水、瓶装水、中水、二次供水、管网水、畜牧用水、医疗用水等。
二、检测原理：酶底物法采用ONPG 和MUG 两种营养指示剂，这两种试剂分别可以被大肠菌群的β-半乳糖苷酶和大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶分解代谢。
当大肠菌群在酶底物检测试剂中生长时，其使用β-半乳糖苷酶分解代谢ONPG，并使样品从无色变为黄色。
大肠杆菌使用β-葡糖醛酸酶分解代谢MUG 时，能够发出荧光。
三、优势特点：酶底物法为GB5750-2006收录的用于大肠杆菌检测标准方法，酶底物法是目前水中大肠杆菌检测的最先进方法，目前在发达国家水质大肠菌群检测分别占到95%和90%的市场，以其方便快捷，假阳性低，适用大量样品快速检测等优点正逐步被国内检测部门所认可。
相对于多管发酵和滤膜法，酶底物法检测步骤大大减少，而且对实验环境要求不高，检测时间可减少到24小时，在日常水样监测及应急监测中具有很好的应用前景，可及时检测，预防，最大限度的减少重大公共安全事故的发生几率。
以GB5750-2006中总大肠菌群测定为例，比较三种方法，如表所示。
表1 多管发酵法、滤膜法及酶底物法比较统计方法优势：1.无需在无菌室内操作。
2.手工操作时间小于1分钟。
3.无需培养基制备和大量玻璃器皿灭菌。
4.24小时即可完成定性定量分析，无需验证试验。
已经列入1.GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法》微生物指标。
产品特点：1.colitech酶底物法检测试剂，LK定量检测盘/定量孔板，LK定量瓶出厂前均已灭菌，客户可以直接放心使用。
2.colitech酶底物法检测试剂是我公司潜心研制并符合GB/T5750.12-2006的酶底物法培养基，假阳性和假阴性均优于传统方法。
大肠菌群和埃氏大肠杆菌快速检测方法-colitag
主要内容
• • • • • 基本概念 Colitag方法特点 基本介绍 检测过程 第三方认可
基本介绍
• 总大肠菌群酶底物法 在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶的细菌群落， 该细菌群落能分解色原底物释放色原体使培养基呈现颜色 变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法称为总大肠 菌群酶底物法 • 埃氏大肠杆菌酶底物法 在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶，分解色原底 物，释放出色原体，从而使培养基颜色发生变化。同时， β-葡萄糖醛酸酶分解产生荧光物质，使菌落能够在紫外光 照射下产生特征性荧光，以此技术检测埃氏大肠杆菌的方 法称为埃氏大肠杆菌酶底物法。
检测过程
1. 取一包检测试剂，与 100 mL 被测液体混合； 2. 摇匀混合，充分溶解，若要定量则转移溶液至定量盘，在 35 摄氏度 的环境下培养 22-26 小时。培养后的水样进行以下认定：
A：如果水样呈黄色，说明有大肠菌群存在； B：如果用 366 nm UV灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏 大肠杆菌存在。
检测微生物种类：可同时检测大肠菌群和埃氏大肠杆菌，或同时检 测粪大肠杆菌和埃氏大肠杆菌 • 检测结果表达方式：可检测有/无，也可检测最可能细菌数（MPN） • 检测所需配套设备：可调恒温培养箱（至少可以控制 35+0.5 摄氏 和44.5+0.2 摄氏度），专用计数盘（如果只检测“有/无”则不需要此 项），366 nm UV灯（用 366 nm UV灯照射观察荧光）。 • 方法权威性：美国国家环保局认可的标准快速检测方法; 中国国家 标准中规定的“酶底物”法； 日本、韩国、 法国和巴西等国家的国家 标准。拥有“acid resuscitation”新技术专利 • 检测下限：1CFU/100mL 液体
检测大肠菌群和大肠埃希氏菌的新方法——固定底物技术酶底物法
卫生学评价 ， 检测的指标为大肠 菌群和大肠埃希 氏菌 或粪大肠菌群 （ 耐热大肠菌群） 以这些指标作为粪便 ， 污染的指示 菌。 采用的标准检测方法为膜过滤法和多 管发酵法。但这两种方法检测时间相对较长 ， ４— 需 ８ ７ ２小时 ， 需验 证 试 验 ， 验 步骤 较 为 繁 琐 ， 以 不 能 试 所
ｔｏ ｈｎ ｌ ｒｐ ｅｙ－ｐ－ －ｇｌｃｏ ｙ ａ ｏｉｅ 使培 养液 呈 黄 Ｄ ａａｔｐ ｒｎ ｓ ） ｄ
３２ 耗材 ： ． 取样 瓶或 使 用 灭 菌的 玻 璃瓶 ；ｌ 定 ５孔
量盘 或 ９ ７孔定 量盘 。
注 ： 孔定 量盘 可在 无需 稀释 的情 况 下 检测 ｌ ５ ｌ ～
２ 放在 ３ ±１ ） ６ ℃培养箱 ， 培养 ２ 小时 ； ４ 注： 如检测耐热大肠菌群 （ 粪大肠菌群） 则需放在
４ ．℃ ， ４５ 培养 ２ ４小时 ； 果 培养 时 间超过 ２ 时 ， 如 ８小 呈 阴性 结果 则结果 有效 ，如果 呈 阳性 结果 则结 果 无效 ， 需 重做 此水样 。
可在 ２ ４小时内同时定量检测出大肠茵群和 大肠埃希 氏菌。 此方法大大的减少 了 工作量 ， 免 了 避 使用 多管法的逐 级稀释带来的操作误差 ； 也避免 了使用滤膜 法时肉眼读数的人 为误差， 所以其假 阳性率和假 阴性率都比传统方
法低 。 由于 ２ ４小时 内就得 到 结果 ， 以很 好 的用 于 突发事件应 急 。 可
关键词 ： 大肠菌群 大肠埃希氏菌 固定底物酶底物 法 Ｃ ｌｅｔ可立得 试剂 ｏｌ （ ｉｒ
１背 景
出水 样 中大肠 菌群和 大肠埃 希 氏菌 的 ＭＰ 值 。 Ｎ
目前 我 国对 生 活饮 用 水 、 源 水 、 水 地表 水 等 进 行
酶底物法系统
西安立科环保科技有限公司水质大肠菌群酶底物法检测系统介绍一、检测用途：酶底物法测定用途：用于检测水中总大肠菌群粪大肠菌群（耐热大肠菌群）和大肠埃希氏菌。
可用于检测水的类型：饮用水、水源水、废水、食品水、地表水、地下水、海水、瓶装水、中水、二次供水、管网水、畜牧用水、医疗用水等。
二、检测原理：酶底物法采用ONPG 和MUG 两种营养指示剂，这两种试剂分别可以被大肠菌群的β-半乳糖苷酶和大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶分解代谢。
当大肠菌群在酶底物检测试剂中生长时，其使用β-半乳糖苷酶分解代谢ONPG，并使样品从无色变为黄色。
大肠杆菌使用β-葡糖醛酸酶分解代谢MUG 时，能够发出荧光。
三、优势特点：酶底物法为GB5750-2006收录的用于大肠杆菌检测标准方法，酶底物法是目前水中大肠杆菌检测的最先进方法，目前在发达国家水质大肠菌群检测分别占到95%和90%的市场，以其方便快捷，假阳性低，适用大量样品快速检测等优点正逐步被国内检测部门所认可。
相对于多管发酵和滤膜法，酶底物法检测步骤大大减少，而且对实验环境要求不高，检测时间可减少到24小时，在日常水样监测及应急监测中具有很好的应用前景，可及时检测，预防，最大限度的减少重大公共安全事故的发生几率。
以GB5750-2006中总大肠菌群测定为例，比较三种方法，如表所示。
表1 多管发酵法、滤膜法及酶底物法比较统计方法优势：1.无需在无菌室内操作。
2.手工操作时间小于1分钟。
3.无需培养基制备和大量玻璃器皿灭菌。
4.24小时即可完成定性定量分析，无需验证试验。
已经列入1.GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法》微生物指标。
产品特点：1.colitech酶底物法检测试剂，LK定量检测盘/定量孔板，LK定量瓶出厂前均已灭菌，客户可以直接放心使用。
2.colitech酶底物法检测试剂是我公司潜心研制并符合GB/T5750.12-2006的酶底物法培养基，假阳性和假阴性均优于传统方法。
固定底物技术酶底物法 技术参数
微生物固定底物技术酶底物法测定仪原理：科立得--DST酶底物法是可在24小时内快速定量和定性检测“总大肠菌群及大肠埃希氏菌及粪大肠菌群”，其原理是利用了MMO-MUG特异性培养基的呈色和荧光反应，该方法比传统的滤膜法和多管法的假阳性和假阴性发生率更低，培养时间更短。
技术特点：1、DST酶底物法试剂完全符合《生活饮用水标准检验方法》的MMO-MUG 培养基，采用固定底物技术（DST）酶底物法，Snap包装。
200个/包。
能够精确检出100ml水样中单个的活性总大肠菌群和大肠埃希氏菌，以及粪大肠菌群，假阴性率低。
每个单位试剂可抑制200万个异养细菌，假阳性率低。
能够消除传统方法中的主观判断影响，准确性高于滤膜法及多管发酵法。
2006年被列入到《生活饮用水标准检验方法》（GB/T5750.12-2006），是国标认可的MMO-MUG培养基；经美国环保署的认可作为24 小时检验出厂水与源水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠菌群）的方法；通过水与废水检验的标准方法分析化学工作者协会 (AOAC) 、国际瓶装水协会 (IBWA) 及欧洲瓶装水协会 (EBWA)认证；中国、美国、加拿大、英国、德国、法国、日本、韩国、阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰、南非等50多国家及地区的饮用水，地表水，污水等检验标准。
年全球使用量超过数千万次，美国90%以上的实验室使用科立得试剂。
2、定量盘Quanti-tray或Quanti-tray 2000定量盘Quanti-tray（51孔定量盘），有50个标准孔格，1个大孔格。
无须稀释可检测200MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群Quanti-tray2000（97孔定量盘），有48个标准孔格，1个大孔格和48个小孔格，无须稀释可检测2419MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群3、无菌取样瓶含10%硫代硫酸钠10ml的无菌取样瓶，可定量100ml水样4、2009D程控定量封口机与符合《生活饮用水标准检验方法》固定底物技术（DST）酶底物法的MMO-MUG培养基配套使用的2009D程控定量封口机。
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浅述酶底物法快速测定地表水中总大肠菌群与大肠埃希氏菌摘要：根据《生活饮用水卫生标准》中对微生物指示菌检测的方法要求，提出采取精确、快速、可靠的总大肠菌群及大肠埃希氏菌检测方法，通过试验方法对比、实际水样检测，比较酶底物法与多管发酵法、滤膜法用于生活饮用水地表水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测结果。
实验结果表明，酶底物法能够快速检测地表水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌，结果精确、快速、可靠，并认为在控制流行疾病的发生传播，从而保障公众健康安全有重要的预报价值和科学意义，同时鉴于我省大多数自来水公司的水质检测还没有增加此方法,建议今后该方法应得到普及和应用。
关键词：总大肠菌群；大肠埃希氏菌；酶底物法
我国新的国家《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）中对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生评价时，总大肠菌群（Total coliforms）和大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是判定水质是否被粪便污染的两个重要指标，尤其是大肠埃希氏菌是粪便污染最有意义的指示菌，已被世界上许多组织、国家和地区使用。
新的国家《生活饮用水卫生标准》中加入大肠埃希氏菌指标，限值为100mL 不得检出大肠埃希氏菌。
并注明：若检出总大肠菌群，必须进行耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌检测。
若水样中检出耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌，则说明水质可能受到严重污染，必须采取相应措施。
目前，新国标中对总大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定有三种标准方法，多管发酵法、滤膜法和酶底物法，其中多管发酵法和滤膜法是目前常用的传统检测方法，这两种方法设备简单，试验步骤较为繁琐，对操作人员专业水平要求较高，不利于应急检测，和对水的卫生学状况做出快速评价。
酶底物法检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌具有操作方便、快速；干预性结果容易判断等特点，适用于水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的快速检测，对于及时准确的监测饮用水、地表水和水源水粪便污染状况，从而有效预报和控制
流行疾病的发生与传播有重要意义。
本文分别采用国标中的二种检测方法对地表水中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌进行检测，通过比对，得出酶底物法不仅适用于地表水检测，还适用于应急检测，易于推广，可以较好的弥补传统方法的不足。
1 实验部分
1.1总大肠菌群和大肠埃希氏菌快速检测法原理
酶底物法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶（β-D- galactosidase）的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，同时能产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法。
1.2 主要设备和试剂
（1）设备
100mL稀释瓶（能耐高压的灭菌玻璃瓶）；1mL、10 mL移液管或移液枪；生化培养箱（36℃±1℃）；高压灭菌器；爱德士（IDEXX）定量培养用无菌塑料定量盘；爱德士（IDEXX）程控定量封口机；6W 波长365nm的紫外灯。
（2）试剂
培养基：MMO-MUG，该实验固定底物技术所需的MMO-MUG培养基采用市售科立得（Colilert）商品化制品。
生理盐水： 8.5g/L 用于稀释样品。
1.3 方法步骤
1.3.1 水样采集和稀释
检测水样需100 mL.如果水样污染严重，可对水样进行稀释。
用灭菌后的无菌玻璃管取10 mL水样加入到90 mL灭菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。
1.3.2 定性反应
（1）用100 mL的无菌稀释瓶量取100 mL水样，加入一瓶科立得（Colilert）成品MMO-MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。
（2）在36±1℃培养箱中培养24小时。
（3）根据表1的说明判断定性检测结果。
表1 定性判读结果
1.3.3 定量分析
（1）用100 mL 的无菌稀释瓶量取100 mL 水样，加入MMO-MUG 培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。
见图1。
（2）将前述100mL 水样全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡。
见图2.
（3）用爱德士（IDEXX ）程控定量封口及封口后，在36±1℃ 培养箱中培养24小时。
见图3.
（4）根据定性结果，数出阳性格子数后对照MPN
表得到定量检测结果。
见
图
4。
图1 图2 图3 图4
2 实验结果与分析 2.1 实验结果的判读
将水样培养24h 后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28h 进行结果判读，超过28h 之后出现的颜色反应不作为阳性结果。
2.2 实际水样检测结果
本次实验分别采集三个不同地方的地表水进行同一方法（酶底物法）平行比对，不同方法（酶底物法和多管发酵法）比对实验，具体结果如下：
（1）地表水水样平行检测结果（酶底物法）
选取三个不同地表水源水样采用酶底物法进行多次平行检测，具体检测结果见表2。
表2
（2）同一水样不同检测方法比对（酶底物法和多管发酵法）
选取同一地表水源水样进行酶底物法和多管发酵法进行方法比对试验，具体试验结果如下图5、图6。
图5
图6
2.3结果分析和讨论
对酶底物法平行测定结果进行统计学分析，
对酶底物法和多管发酵法测定地表水样两组结果进行T检验，当置信度为95%
时，对照t值表t= ,而t
计值= ，，结果t
计
<t，检验结果说明两种方法不存在显
著性差异。
3 结语。