水中大肠杆菌测定教案(精)
水中大肠杆菌细菌总数的检测——环境微生物学实验七
MPN:maximum probable number） MPN计数又称稀释培养计数，适用于测定在一 个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有 特殊生理功能的类群。 水中以100mL水样中大肠杆菌最近似数MPN来表 示 食品中大肠杆菌群数是以每100g检样大肠杆菌 最近似数MPN来表示。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的 选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通 过该生理功能的表现来判断该类群微生物的 存在和丰度。 缺点：只适于进行特殊生理类群的测定，结 果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平 板计数时才采用。 其可靠性是基于检测对象在取样总体中符合 泊松分布。
③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每
稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。
2）LST发酵 接种1mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接 种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土 1)℃温箱内培养（48士2) h。
如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为
大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序
六 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN检索表，
报告每100mL样品大肠菌群的MPN。
结果表示方法：NMPN/100mL
附表：大肠杆菌计数最大可能数（MPN）检索表
注：
①本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和
0.01 mL (g)。每稀释度3管。
②表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和
根据以上所获得的数据 报告表示为：N cfu/100mL cfu(Colony-Forming Units)
5.3实验所需培养基及作用
LST肉汤培养基（初发酵）
EC肉汤培养基（复发酵）
伊红美蓝琼脂培养基（ 分离培养）
5.水中大肠杆菌的检测（多管发酵法）
5.水中大肠杆菌的检测（多管发酵法）第一篇：5.水中大肠杆菌的检测(多管发酵法)水中大肠杆菌群书的监测（发酵法）一、试验目的：1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。
2.学习和掌握水中大肠杆菌的监测方法。
二、试验原理：水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。
多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅用于自来水和深井水。
操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。
三、试验材料：1.培养基：乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基2.器材：灭菌三角瓶、无菌平皿、无菌吸管、无菌试管等。
四、试验内容第一天：1.水样的采集自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。
2.用发酵法检查大肠杆菌（1）生活饮用水的检验①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。
摇匀后，37℃培养24ｈ第二天：②平板分离：经24ｈ培养后。
特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。
大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
第三天：③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
第四天：④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查附录1或2，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）五、思考题记录试验结果，并对所测样品作出评价。
实验八 水中大肠杆菌的测定
（三）多管发酵法检测大肠菌群
1.取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每支分别 加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵 管，每支分别加入水样1mL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养 基的初发酵管，每支分别加入按1：10稀释的水样1mL，均 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
三、实验材料和用具
1、培养基 复红亚硫酸钠培养基、乳 糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨 培养液、3倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊 红美兰培养基。
2、仪器及用具 微孔滤膜（0.45um）、 滤器（500mL）、抽气设备、镊子、 发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻 度吸管或移液管、接种环、酒精灯。
四、操作步骤
（一）水样的采集
1.自来水 将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌， 在拧开水龙头流水5min，以排除管道内积存的死 水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样。
2.池水、河水、或湖水 将无菌的带玻璃塞的小口 瓶侵入距水面10~15cm深的水层中，瓶口朝上， 除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取 出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超 过24h。
（二）滤膜法检测大肠菌群
1.无菌滤膜 无菌镊子 滤器膜承受器，过滤杯——滤膜承 受器，旋紧。真空泵——抽气口
2.水100mL滤杯，启动抽真空系统，使水从下端流出。 3.有细胞的滤膜 无菌镊子 平贴于复红亚硫酸钠固体培养
基上（紧贴，无气泡），37℃培养16~18h。挑选红色或紫 红色、带有或不带有金属光泽的菌落，或淡红色、中心颜 色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。 4.经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，接种到乳糖蛋白 胨半固体培养基上， 37℃培养6~8h后观察，产气者为阳 性（观察要及时，以免气泡消失） 5.结果计算
微生物综合实验水中细菌总数和大肠菌群的测定(精)
微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。
大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。
大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。
本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料和用具：1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。
2、试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。
3、器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。
四、实验步骤第一周（2008-11-11）1、制备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。
2、配制：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）乳糖蛋白胨培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基（将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制）3、将以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。
水中大肠杆菌测定教案
教案教师姓名王承莉讲课班级0911 食品讲课地址系实训室讲课日期2011 年5 月 29 日第 14 周讲课时数 2讲课内容学习情境 6 微生物检测任务二：水中大肠杆菌的测定1、学生依据任务通知单采集信息2、学生领取工作任务并梳理和学习有关知识（1）中国安全饮用水国家标准 GB5479-2006 ；细菌培育的条件（2）大肠杆菌的特征：能发酵乳糖产酸产气教课方案（ 3）培育基的配制、灭菌技术；（ 4）细菌培育和分别纯化的操作过程；革兰氏染色判定等3、依据任务单初步写出检测方案4、学生疏组议论、教师指导总结，最后确立检测方法5、学生依据检测方案对水样进行检测，填写查验报告6、教师对学生任务达成状况进行总结剖析知识1、掌握安全饮用水标准、大肠杆菌特征及检测方法及培育细菌的条件教课目的目标2、学会使用 MPN检索表能力1、掌握培育基配制技术目标2、掌握过微生物发酵培育技术3、掌握分别纯化技术教课要点、要点：发酵试验、分别培育难点难点：复发酵考证能力训练1、发酵培育任务2、分别纯化课外作业 1.大肠菌群的定义是什么？有何特色？2.大肠菌群以为是被肠道病原菌污染的指示菌，为何？3.乳糖胆盐培育基是哪一种类的培育基？课后领会审阅评语审阅人讲课主要内容及板书设计第一步：依据任务通知单指引学生采集信息，进行课程导入水质安全事故频发，水质查验势在必行。
大肠菌群是评论水质利害的一个重要的卫生指标，也是反应水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
第二步：依据工作任务，采集有关信息，获取有关知识一、大肠杆菌的特征大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h 发酵乳糖并产酸才产气。
二、食品中大肠菌群的含义和有关标准食品中大肠菌群数是以每100mL （ g）检样内大肠菌群近来似数（简称MPN ）表示。
据此含义，全部食品卫生标准中所规定的大肠菌群均以100mL（ g）食品内同意含有大肠菌群的实质数值为报告标准。
实验九 水中总大肠菌群的测定课件
用漏斗分装培养基及摆斜面
培养基的分装： 一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3 ~4毫升(1/4~1/3试管高度)，如制作深层培养基，每只20×220毫米 的试管约装12~15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一 半为宜。
令包扎
1．培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 2．吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉 花要塞得松紧恰当(过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会 下滑)，然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与 报纸约呈60º角，并将右端多余的报纸打一小结。 3 ．三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端， 与报纸约呈45º角，并将右端多余的报纸打一小结。 4. 玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱160－170℃灭菌2h.
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五 操作步骤 1 水样的采取
(1)检测自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，
在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，迅速地进行分析。
(2)检测池水、河水或湖水 应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下
每组：
三倍浓缩乳糖蛋白胨(5ml) 15管 普通浓度乳糖蛋白胨(10ml) 15管 伊红美兰培养基 150ml (5个平板) 三角瓶1个(装27mL蒸馏水灭菌)、 10ml吸管 2支、 1ml吸管2支包扎灭菌
表2 最可能数(MPN)表
(接种5份10mL
水样、 5份1mL水 样、 5份0.1mL水 样时，不同阳性 及阴 性情况下 100mL水样中细 菌数的最可能数 和95%可信限值)
实验九 水中总大肠菌群的测定
实验 水中细菌总数的测定 水中大肠杆菌的测定
实验2 水中大肠菌群数的测定一、目的要求1．了解大肠菌群数量在引用水中的重要性2．学习掌握多管发酵法和滤膜法测定大肠菌群数二、原理若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。
若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。
最广泛应用的指示菌是大肠菌群，它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37ºC、24～48h培养能产酸产气，根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得检出；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。
检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。
多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。
三、实验仪器和材料1．锥形瓶（500 ml）、试管（18 mm×180 mm）、大试管（容积150 ml）、移液管1 ml 及10ml、培养皿（直径90 mm）、接种环、试管架1个。
2．革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液3．显微镜4．自来水（或受粪便污染的河、湖水）400ml5．蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液、5％碱性品红乙醇溶液、2％伊红水溶液、0.5％美蓝水溶液。
6．10％NaOH、10％HCl、精密pH试纸6.4～8.4。
水中大肠杆菌的检测实验报告
1. 掌握水中大肠杆菌检测的基本原理和方法。
2. 了解水中大肠杆菌污染的严重性及预防措施。
3. 培养实验操作技能，提高对水质监测的认识。
二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是一种条件致病菌，广泛存在于人和动物的肠道中。
在水质监测中，大肠杆菌常作为粪便污染的指示菌。
本实验采用伊红美蓝培养基进行大肠杆菌的检测，通过观察菌落特征，确定水中大肠杆菌的存在。
三、实验材料1. 实验器材：无菌试管、移液器、培养箱、酒精灯、无菌棉签、试管架、培养皿、显微镜等。
2. 实验试剂：伊红美蓝培养基、无菌水、水样、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。
四、实验步骤1. 水样采集：采集待检测水样，用无菌容器盛装，避免污染。
2. 水样稀释：将水样进行适当的稀释，以便在培养基上形成单菌落。
3. 接种：取适量稀释后的水样，用无菌棉签均匀涂布于伊红美蓝培养基表面。
4. 培养：将接种后的培养基放入培养箱中，在37℃条件下培养24小时。
5. 观察：观察培养基上的菌落特征，如菌落大小、形状、颜色等，判断是否存在大肠杆菌。
6. 鉴定：对疑似大肠杆菌的菌落进行进一步的鉴定，如革兰氏染色、生化试验等。
五、实验结果与分析1. 菌落观察：在伊红美蓝培养基上，大肠杆菌菌落呈深紫色（黑色），边缘整齐，有金属光泽。
2. 鉴定结果：经革兰氏染色和生化试验，证实所观察到的菌落为大肠杆菌。
1. 大肠杆菌是水质监测中的重要指标，其存在表明水质可能受到粪便污染，存在健康风险。
2. 本实验采用伊红美蓝培养基进行大肠杆菌检测，操作简便，结果准确。
3. 在实际水质监测中，还需结合其他指标，如粪大肠菌群、耐热大肠菌群等，全面评估水质状况。
七、实验总结1. 本实验成功检测了水中大肠杆菌，掌握了水中大肠杆菌检测的基本原理和方法。
2. 通过实验，提高了对水质监测的认识，增强了环保意识。
3. 在今后的学习和工作中，将继续关注水质问题，为保护水资源、保障人民群众健康贡献力量。
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（4）细菌培养和分离纯化的操作过程；革兰氏染色鉴定等
3、根据任务单初步写出检测方案
4、学生分组讨论、教师指导总结，最终确定检测方法
5、学生根据检测方案对水样进行检测，填写检验报告
6、教师对学生任务完成情况进行总结分析
教学目标
知识
目标
1、掌握安全饮用水标准、大肠杆菌特性及检测方法及培养细菌的条件
二、食品中大肠菌群的含义和相关标准
食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群最近似数（简称MPN）表示。据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均以100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据数量的多少，判定食品受污染的程度。我国生活饮用水卫生标准中规定1L水样中总大肠菌群数不超过3个。
三、大肠杆菌的测定方法（乳糖发酵法）
第三步：学生根据工作任务，分组调研，收集资料并尝试制定检测方案
第四步：通过学生分组讨论、教师指导总结，最终确定检测方法
第五步：根据检测方案对水样进行检测，填写检验报告（检测方案见下图）
第六步：分析工作任务的完成情况，存在问题和原因以及解决方案，总结操作过程中的经验和注意事
教案
教师姓名
王承莉
授课班级
0911食品
授课地点
系实训室
授课日期
2011年5月29日第14周
授课时数
2
授课内容
学习情境6微生物检测
任务二：水中大肠杆菌的测定
教学设计
1、学生根据任务通知单收集信息
2、学生领取工作任务并梳理和学习相关知识
（1）中国安全饮用水国家标准GB5479-2006；细菌培养的条件
（2）大肠杆菌的特性：能发酵乳糖产酸产气
根据工作任务单，利用学习资源，对照资讯问题，熟悉天牛形态、发育特征和发生规律，制定天牛的识别及防治计划并组织实施
第七步：考核评价
任务资讯引导单
学习情境2害虫防治
学时16
子学习情境2.2（1）天牛类害虫的识别与防治
学时2
资讯方式
利用教材、教辅材料、精品课程网站、多媒体教学课件等获得相关的任务资讯
资讯
1、天牛的成、幼口器各属于什么类型？
2、天牛的危害有什么特点？本地区常见的有哪些种类？
3、天牛属于什么变态类型？
4、园林植物天牛类害虫难以防治的原因是什么？
课后体会
审阅
评语
审阅人
授课主要内容及板书设计
第一步：根据任务通知单引导学生收集信息，进行课程导入
水质安全事故频发，水质检验势在必行。大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
第二步：根据工作任务，收集相关信息，获得相关知识
一、大肠杆菌的特性
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h发酵乳糖并产酸才产气。
5、光肩星天牛主要为害哪些园林植物？
6、光肩星天牛、星天牛如何区分？
7、光肩星天牛在江苏地区什么时间为害最重？
8、天牛有哪些习性可用于防治？
9、天牛的天敌有哪些？生产上大面积应用的主要是哪些？
10、天牛的防治适期是？
11、天牛的防治方法有哪些？
12、用于防治天牛的高效、安全药剂有哪些？如何使用？
资引导
2、学会使用MPN检索表
能力
目标
1、掌握培养基配制技术
2、掌握过微生物发酵培养技术
3、掌握分离纯化技术
教学重点、
难点
重点：发酵试验、分离培养
难点：复发酵验证
能力训练
任务
1、发酵培养
2、分离纯化
课外作业
1.大肠菌群的定义是什么？有何特点？
2.大肠菌群认为是被肠道病原菌污染的指示菌，为什么？
3.乳糖胆盐培养基是哪一类型的培养基？